用于合成烟酰胺单核苷酸和烟碱酸单核苷酸的酶促系统和方法技术方案

用于合成NAD前体NMN和NaMN的酶基系统和方法被公开。这样的方法和系统利用磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)的超活性的突变形式和/或被固定到固体表面上的其他酶或酶组合。所述方法和系统大幅增加NAD前体合成的效率和产率。

Enzymatic systems and methods for the synthesis of nicotinamide mononucleotides and nicotinic acid mononucleotides

Enzyme based systems and methods for the synthesis of NAD precursors NMN and NaMN are disclosed. Such methods and systems use the hyperactivity mutation of the phosphosrrp (PRS) and / or other enzymes or enzymes that are immobilized to the surface of the solid. The method and system greatly increase the efficiency and yield of NAD precursor synthesis.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成烟酰胺单核苷酸和烟碱酸单核苷酸的酶促系统和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年6月11日递交的美国专利申请No.62/174,412的优先权，其通过引用如前所述全部并入本申请中。关于联邦政府资助的研究或开发的声明不适用背景烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是必需的代谢辅因子。最近的研究已经表明，NAD+水平随着年龄和在某些哺乳动物疾病状态中下降，并且治疗上增加NAD+水平具有健康益处。然而，NAD+是一种细胞内代谢物，并且不容易适用于外部补充。有人提出，将前体应用于NAD+的天然合成可能是增加NAD+的有效途径。能够被施用以增加NAD+的两种示例性前体是被直接合成为NAD+的烟酰胺单核苷酸(NMN)和从NAD+的利用再循环成NMN的烟碱核糖甙(NR)。没有已知的NMN或NR的饮食或环境来源。因此，为了将这些前体用作药物或补充剂，其必须被生产。授予Sauve等的美国专利No.8,106,184描述了用于通过合成化学高效生产NR的方法。不存在这样的用于产生NMN的方法。授予Whitesides和Walt的美国专利No.4,411,995描述了用于产生NMN的酶促工艺，但是这样的方法尽管在其产率方面有高效率，但是需要仔细控制的条件和昂贵的酶的添加。因此，本领域需要一种以高产率、高纯度和较低成本生产NAD前体的改进的方法。本文描述了这样的方法。简述本公开涉及用于NAD前体(如烟酰胺单核苷酸(NMN)和烟碱酸单核苷酸(NaMN))的酶促合成的新方法和系统。例如，Whitesides(1985)、Berghauser(1981)、Dietrich(1966)和Preiss(1957)已经描述了用于产生NMN的各种各样的酶基方法。我们在本文中公开了用于利用一种或更多种改进产生NMN或NaMN的酶基系统和方法。具体地，所公开的系统和方法利用(1)变得对其自身反应产物不敏感的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)的突变形式，从而增加其活性；和/或(2)被结合至固体表面的一种或更多种其他酶或酶组合(可选地包含PRS的所述突变形式)。所使用的一种或更多种酶可以通过重组手段在一种或更多种细胞中产生，所述细胞包含，但不限于酵母、细菌、杆状病毒或哺乳动物细胞系。可替代地，所使用的一种或更多种酶可以在含有细胞的或无细胞的体外翻译系统中产生，如在网织红细胞裂解物中。因此，在第一方面，本公开包括用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体的系统。所述系统包含超活性磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)突变体，其中与野生型PRS相比，所述PRS突变体对所述PRS突变体催化的反应的产物较不敏感。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体包含通过一个或更多个氨基酸取代而与野生型PRS不同的多肽。在一些这样的实施方案中，所述一个或更多个氨基酸取代是人类PRS的Asp51His、人类PRS的Asn113Ser、人类PRPP的Leu128Ile、人类PRS的Asp182His、人类PRS的Ala189Val、人类PRS的His192Gln、非人类PRS中的任何等效取代或这些的任何组合。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体包含一个或更多个亲和标签。在一些这样的实施方案中，所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体是重组产生的、分离的或从细胞纯化的。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体被固定到表面上。在一些这样的实施方案中，所述超活性PRS突变体通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键被固定到所述表面上。在一些实施方案中，所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。在一些实施方案中，所述系统还包含烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)或烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRT)。在一些这样的实施方案中，所述NAMPT或NAPRT包含一个或更多个亲和标签。在一些这样的实施方案中，所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，所述NAMPT或NAPRT是重组产生的、分离的或从细胞纯化的。在一些实施方案中，所述NAMPT或NAPRT被固定到表面上。在一些这样的实施方案中，所述NAMPT或NAPRT通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键合被固定到所述表面上。在一些实施方案中，所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。在其中所述NAMPT或NAPRT被固定到表面上的一些实施方案中，所述PRS突变体也被固定到表面上。在一些这样的实施方案中，所述PRS突变体和所述NAMPT或NAPRT被固定到不同的表面上。在其他这样的实施方案中，所述PRS突变体和所述NAMPT或NAPRT被固定到相同的表面上。在一些实施方案中，所述系统还包含三磷酸腺苷(ATP)。在一些实施方案中，所述系统还包含核糖-5-磷酸。在一些实施方案中，所述系统还包含烟酰胺或烟碱酸。在一些实施方案中，所述系统还包含磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。在一些实施方案中，所述系统还包含烟酰胺单核苷酸(NMN)或烟碱酸单核苷酸(NaMN)。在第二方面，本公开包括用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体的方法。所述方法包含在三磷酸腺苷(ATP)存在的情况下使核糖-5-磷酸与超活性磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)突变体接触的步骤，其中与野生型PRS相比，所述PRS突变体对所述PRS突变体催化的反应的产物较不敏感，并且由此产生磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体包括通过一个或更多个氨基酸取代而与野生型PRS不同的多肽。在一些这样的实施方案中，所述一个或更多个氨基酸取代可以是人类PRS的Asp51His、人类PRS的Asn113Ser、人类PRPP的Leu128Ile、人类PRS的Asp182His、人类PRS的Ala189Val、人类PRS的His192Gln、非人类PRS中的任何等效取代，以及这些的任何组合。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体包含一个或更多个亲和标签。在一些这样的实施方案中，所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体是重组产生的、分离的或从细胞纯化的。在一些实施方案中，所述超活性PRS突变体被固定到表面上。在一些这样的实施方案中，所述超活性PRS突变体通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键被固定到所述表面上。在一些实施方案中，所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。在一些实施方案中，所述方法还包含以下步骤：(a)在烟酰胺存在的情况下使生成的PRPP与烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)接触，由此产生烟酰胺单核苷酸(NMN)；或(b)在烟碱酸存在的情况下使生成的PRPP与烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRT)接触，由此产生烟碱酸单核苷酸(NaMN)。在一些实施方案中，所述NAMPT或NAPRT包含一个或更多个亲和标签。在一些这样的实施方案中，所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。在一些实施方案中，所述NAMPT或NAPRT是重组产生的、分离的或从细胞纯化的。在一些实施方案中，所述NAMPT或NAPRT被固定到表面上。在一些这样的实施方案中，所述NAMPT或NAPRT通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键合被固定到所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体的系统，所述系统包括超活性磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)突变体，其中与野生型PRS相比，所述PRS突变体对所述PRS突变体催化的反应的产物较不敏感。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.11 US 62/174,4121.一种用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体的系统，所述系统包括超活性磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)突变体，其中与野生型PRS相比，所述PRS突变体对所述PRS突变体催化的反应的产物较不敏感。2.如权利要求1所述的系统，其中所述超活性PRS突变体包括通过一个或更多个氨基酸取代而与野生型PRS不同的多肽。3.如权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述一个或更多个氨基酸取代选自由人类PRS的Asp51His、人类PRS的Asn133Ser、人类PRPP的Leu128Ile、人类PRS的Asp182His、人类PRS的Ala189Val、人类PRS的His192Gln、非人类PRS中的任何等效取代，及其任何组合组成的组。4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中所述超活性PRS突变体包括一个或更多个亲和标签。5.如权利要求4所述的系统，其中所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中所述超活性PRS突变体是重组产生的、分离的或纯化的。7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述超活性PRS突变体被固定到表面上。8.如权利要求7所述的系统，其中所述超活性PRS突变体通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键合被固定到所述表面上。9.如权利要求7或权利要求8所述的系统，其中所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，所述系统还包括烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)或烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRT)。11.如权利要求10所述的系统，其中所述NAMPT或NAPRT包括一个或更多个亲和标签。12.如权利要求11所述的系统，其中所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。13.如权利要求10-13中任一项所述的系统，其中所述NAMPT或NAPRT是重组产生的、分离的或纯化的。14.如权利要求10-13中任一项所述的系统，其中所述NAMPT或NAPRT被固定到表面上。15.如权利要求14所述的系统，其中所述NAMPT或NAPRT通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键合被固定到所述表面上。16.如权利要求14或权利要求15所述的系统，其中所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。17.如权利要求14-16中任一项所述的系统，其中所述PRS突变体也被固定到表面上。18.如权利要求17所述的系统，其中所述PRS突变体和所述NAMPT或NAPRT被固定到不同的表面上。19.如权利要求17所述的系统，其中所述PRS突变体和所述NAMPT或NAPRT被固定到相同的表面上。20.如权利要求1-19中任一项所述的系统，所述系统还包括三磷酸腺苷(ATP)。21.如权利要求1-20中任一项所述的系统，所述系统还包括核糖-5-磷酸。22.如权利要求1-21中任一项的系统，所述系统还包括烟酰胺或烟碱酸。23.如权利要求1-22中任一项所述的系统，所述系统还包括磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。24.如权利要求1-23中任一项所述的系统，所述系统还包括烟酰胺单核苷酸(NMN)或烟碱酸单核苷酸(NaMN)。25.一种用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)前体的方法，所述方法包括在三磷酸腺苷(ATP)存在的情况下使核糖-5-磷酸与超活性磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)突变体接触，其中与野生型PRS相比，所述PRS突变体对所述PRS突变体催化的反应的产物较不敏感，并且由此产生磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。26.如权利要求25所述的方法，其中所述超活性PRS突变体包括通过一个或更多个氨基酸取代而与野生型PRS不同的多肽。27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述一个或更多个氨基酸取代选自由人类PRS的Asp51His、人类PRS的Asn133Ser、人类PRPP的Leu128Ile、人类PRS的Asp182His、人类PRS的Ala189Val、人类PRS的His192Gln、非人类PRS中的任何等效取代，及其任何组合组成的组。28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述超活性PRS突变体包括一个或更多个亲和标签。29.如权利要求28所述的方法，其中所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述超活性PRS突变体是重组产生的、分离的或纯化的。31.如权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述超活性PRS突变体被固定到表面上。32.如权利要求31所述的方法，其中所述超活性PRS突变体通过吸附、亲和结合、离子键合或共价键合被固定到所述表面上。33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述表面是珠的表面或所述表面包括树脂。34.如权利要求25-33中任一项所述的方法，所述方法还包括：(a)在烟酰胺存在的情况下使所述生成的PRPP与烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)接触，由此产生烟酰胺单核苷酸(NMN)；或者(b)在烟碱酸存在的情况下使所述生成的PRPP与烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRT)接触，由此产生烟碱酸单核苷酸(NaMN)。35.如权利要求34所述的方法，其中所述NAMPT或NAPRT包括一个或更多个亲和标签。36.如权利要求35所述的方法，其中所述亲和标签是6xHis标签或谷胱甘肽S-转...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·吴，D·A·辛克莱，K·密茨，
申请(专利权)人：新南创新私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU