一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种突变Taq DNA聚合酶及其在大肠杆菌中的纯化方法。本发明专利技术采用现代基因工程技术，将天然Taq DNA聚合酶进行突变，去除了其5‘‑3’的DNA外切酶活性，并且引入E507R,E742A和A743H（氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定）突变。和野生型Taq DNA聚合酶相比，此突变型Taq DNA聚合酶具有更高的热稳定性和抗生物样品中不纯成分对聚合酶的抑制作用，使其更加适应科研及临床应用需求。其纯化工艺采取简便、快速、高产率的特异性亲和柱，获得的突变型Taq酶质量高、成本低、十分适合工业放大生产。

A mutant TaqDNA polymerase and its purification method

The invention discloses a mutant Taq DNA polymerase and its purification method in Escherichia coli. The present invention uses modern genetic engineering technology to mutate natural Taq DNA polymerase and remove the DNA exoenzyme activity of its 5 '3', and introduce E507R, E742A and A743H (amino acid position according to the wild type Taq DNA polymerase) mutation. Compared with the wild type Taq DNA polymerase, the mutant Taq DNA polymerase has higher thermal stability and the inhibition of the PCR in the anti biological samples, making it more suitable for scientific research and clinical application. Its purification process adopts a specific affinity column, which is simple, rapid and high yield. The quality of the mutant Taq enzyme is high and the cost is low. It is very suitable for industrial amplification.

【技术实现步骤摘要】
一种突变TaqDNA聚合酶及其纯化方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种突变型TaqDNA聚合酶及其纯化方法。
技术介绍
TaqDNA聚合酶是A.Chien从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)YTI株分离提取的。所述yT1株是一种嗜熟真细菌于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的，适合生长在70-75℃生长，。TaqDNA聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa,80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒。TaqDNA聚合酶在95℃酶活性可以持续40分钟，而97.5℃加热5-6分钟可以保持大约50%的酶活。TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的自动连续循环的前提条件，也是PCR反应能在生物
迅速发展和广泛应用的原因。DNA聚合酶作为分子生物学的工具酶，在生物技术和医学临床上的应用十分广泛，具有较高的市场价值。然而随着医药科技的发展，新领域的应用对DNA聚合酶的性能不断提高，原有的野生型TaqDNA聚合酶已经不能满足新的应用要求，如TaqDNA聚合酶容易被血液、粪便中的化学成分所抑制，导致实验或检测的失败。因此需要对野生型TaqDNA聚合酶进行改造和筛选，得到新的突变体来适应科研、医学应用和工业生产的需求。传统的野生型TaqDNA聚合酶纯化步骤较多，生产过程中所需多步柱上层析，费时长且产率低。1993年Francesc.Lawyer等人采用肝素柱对TaqDNA聚合酶进行亲和纯化，肝素柱虽然特异性比较高，但是载量比较低，不利于放大生产。1994年Harrell和Hart报导的TaqDNA聚合酶纯化方法中提到了用离子交换的方法，1995年EdithGrim报道TaqDNA聚合酶纯化方法中也包含了离子交换的方法。在此以后的大多数关于TaqDNA聚合酶纯化方法的文章中也都采用了离子交换的工艺.离子交换的工艺虽然能提高载量，但是由于他本身的非特异性洗脱会导致杂蛋白的含量会增多，如果达到一定的纯度要求还需进行其他步骤的纯化，这会增加工艺的复杂度以及提高成本。鉴于此，开发简便、快速、高效、低成本的工业化可行的TaqDNA聚合酶纯化方法是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种突变型TaqDNA聚合酶及其制备方法。和野生型TaqDNA聚合酶，对样品中不纯的化学成分具有更强的抗抑制作用。根据上述目的，本专利技术提供一种突变型TaqDNA聚合酶，其核苷酸和氨基酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。突变的氨基酸位置根据野生型TaqDNA聚合酶所定，野生型TaqDNA聚合酶为SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了一种蛋白表达载体，该载体包含了可编码此突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列；此载体可由大肠杆菌表达载体，如pET15b等表达载体经重组得到。本专利技术提供了一种大肠杆菌蛋白表达菌株，该菌株包含上述的一种蛋白表达载体可编码上述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。上述表达菌株可以为BL21(DE3)等。本专利技术还提供了一种上述突变型TaqDNA聚合酶的制备方法,其包括：（1）破菌：将含突变型TaqDNA聚合酶表达菌株用超声或高压均质的方法裂解菌体；（2）热处理：加热裂解液使不耐热蛋白变性析出；（3）盐析：40%的硫酸铵盐析浓度可保留突变型TaqDNA聚合酶在上清而去除大部分杂质蛋白；（4）Ni离子金属螯合亲和层析：特异性吸附和特异性洗脱实现了快速制备大量的突变型TaqDNA聚合酶；（5）制剂分装：测量纯化的突变型TaqDNA聚合酶的酶活并根据活性酶量进行分装。本专利技术公开了该突变型TaqDNA聚合酶在PCR中的应用。本专利技术具有以下有益效果：它可以比野生型TaqDNA聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。本专利技术提供的突变型TaqDNA聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。附图说明图1为突变型TaqDNA聚合酶纯化结果。1.野生型TaqDNA聚合酶，2.突变型TaqDNA聚合酶。图2为检测粪便DNA中的16srRNA基因时突变型TaqDNA聚合酶和野生型TaqDNA聚合酶的对比图。1，2野生型TaqDNA聚合酶（NEB）；3，4野生型TaqDNA聚合酶（强微特）；5,6突变型TaqDNA聚合酶（强微特）。图3为检测血液DNA中的b-actin基因时突变型TaqDNA聚合酶和野生型TaqDNA聚合酶的对比图。图中上曲线：突变型Taq,下曲线：野生型Taq。具体实施方式本专利技术采用分子生物学技术，将天然TaqDNA聚合酶的5‘-3’外切酶活性部分去除，并进行多个位点的氨基酸进行突变，经过测序确认突变型后重组到表达载体中，该突变型TaqDNA聚合酶可以比野生型TaqDNA聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。该突变型TaqDNA聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。本专利技术中，上述突变具体涉及野生型TaqDNA聚合酶的C端281-氨基酸，并且在天然TaqDNA聚合酶氨基酸序列中引入E507R,E742A和A743H突变。在本专利技术的一种实施方式中，其突变型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，包括了去除具有5‘-3’外切酶活性部分的1-280氨基酸，第507位由谷氨酸突变为精氨酸，第742位由谷氨酸突变为丙氨酸，第743位由丙氨酸变为组氨酸。本专利技术中还进一步提供了可编码上述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示。本领域技术人员可以运用分子生物学的方法，进行克隆或者点突变而得到此突变型TaqDNA聚合酶。上述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，并不是唯一得到上述突变型TaqDNA聚合酶的序列。本领域技术人员可以利用密码子的同义突变核苷酸序列，得到具有相同氨基酸序列而不同核苷酸序列的DNA片段。我们为了简化纯化、提高产率，针对含有6个组氨酸标签的突变型TaqDNA聚合酶，开发了一种简便、高效的纯化方法，纯化的突变型TaqDNA收率高、生产成本低，有利于工业化生产的特点。纯化采用以下的技术方案：破菌：离心获得表达突变型TaqDNA聚合酶的重组大肠杆菌菌体，以1：10比例加入破菌缓冲液，搅拌20min使之混合均匀，通过高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；其中破菌缓冲液为50mMTris-HCl,pH7.5,0.5mMEDTA,0.5MKCI,1％Tween,1％NP-40，溶菌酶2mg/ml,新鲜PMSF至0.02mM。将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，在4℃、工作压力为500bar时均质3遍。热处理:先将水浴锅加热到70℃，将破菌离心上清液装入一玻璃容器中一并放入预先加热好的水浴锅中。热处理时间是60min,热处理后会有很多不耐热蛋白变性析出。离心力控制在10000g,时间20min,温度4℃。盐析:硫酸铵盐析浓度为40％左右，导致目的蛋白收率轻微下降，对后续纯化纯度没有影响。具体操作为：事先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中一次性加入，搅拌至完全溶解，确保不会出现局部浓度过高，100ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于所述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列为SEQ. ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种突变型TaqDNA聚合酶，其特征在于所述突变型TaqDNA聚合酶的核苷酸序列为SEQ.IDNO.1所示。2.编码如权利要求1所述的TaqDNA聚合酶氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列为SEQ.IDNO.2；或与SEQ.IDNO.2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽。3.所述核苷酸序列为SEQ.IDNO.1所示序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。4.一种载体，其特征在于所述载体含有权利要求2或者权利要求3所列出的核苷酸序列或者重组可以得到权利要求2或3的核苷酸序列。5.一种原核生物外缘蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，王磊，郑春阳，
申请(专利权)人：天津强微特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12