一种用于分离溶菌酶的亲和层析介质及其制备方法技术

本发明专利技术属于蛋白纯化试剂领域，具体而言，本发明专利技术涉及一种以甲壳素为原料的亲和层析介质及其制备方法。本发明专利技术采用甲壳素为原料，制备分离纯化溶菌酶的亲和色谱介质。本发明专利技术采用的制备方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流速较快；采用甲壳素亲和介质纯化人溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可从发酵液中分离到近１００％的纯度的溶菌酶，纯化效率明显高于离子交换层析。因此，本研究的甲壳素亲和介质制备工艺可适用于大规模的工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白纯化试剂领域，具体而言，本专利技术涉及一种以甲壳素为原料 的亲和层析介质及其制备方法。
技术介绍
亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固 结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的 配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、 激活剂、辅因子，抗体-抗原，激素-受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素-多糖、糖 蛋白、细胞表面受体，核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等亲和层析中配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关，因 此可以用分子间相互作用的平衡常数K D来衡量亲和作用强度。但它们的结合力 仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等。所以，除了可改变 配基以改变亲和层析的作用强度以外，还可以通过改变pH和离子强度的方法来改 变配基与生物大分子之间的亲和力，从而达到洗脱的目的。但由于亲和层析的多样 性，洗脱的条件常常需要通过实验来获得。除此以外，还可运用其它配基、抑制剂 等物质与出层析剂上的配基或生物大分子产生竞争性结合，达到洗脱的目的，这种 方法被称为专一性洗脱。专一性洗脱可以获得很高的分辨能力，但洗脱剂的价格较 高，所以常与普通洗脱配合使用。值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基。溶菌酶的用途相当广泛。在国外，溶菌酶普遍的应用在食品的杀菌、保鲜、 防腐以及微生物发酵和生物工程技术中菌体内容物如核酸、蛋白质、抗生素、酶等 的提取。在医药和临床上，溶菌酶制成的各种药物具有抗菌抗病毒、消炎、消肿、 增强抗菌素疗效等作用。在国内，溶菌酶尚未得到充分应用，主要是由于国内生产 溶菌酶的产量低、质量差，医药、食品及科研用溶菌酶仍依赖进口。随着食品工业、 微生物工业和生物工程技术的迅速发展，以及溶菌酶在医药领域上的推广应用，人们对溶菌酶的需求量与日俱增，同时，对溶菌酶质量的要求也越来越高，因此，许 多研究者都在寻找新的溶菌酶分离纯化技术，以提高溶菌酶产品的纯度及活性。到目前为止，尚未有报道将甲壳素作为亲和层析介质，即配体，用于分离溶菌酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简易、成本低廉并且高效的用于溶菌酶分离的 亲和层析介质。本专利技术的另一个目的是提供上述介质的制备方法。本专利技术提供了一种亲和层析介质，该层析介质是碱化后的甲壳素。甲壳素即2-^乙酰氨基-2_脱氧-日-1， 4-葡萄糖，是由2-N-乙酰氨基-D-葡萄 糖通过P -1， 4糖苷键聚合而成的直链含氮多糖，是与纤维素结构极为相似的天然高 分子。本专利技术所用的甲壳素可以以目前各类市售产品为原料，例如，sigma公司的 (C7170)，以及济南海得贝海洋生物工程有限公司，青岛海普生物技术有限公司， 潍坊科海甲壳素有限公司等公司的商品。本专利技术中，将甲壳素在10-3(TC条件下碱化6-36小时后，静置并洗至中性，从 而制成层析介质。所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者几种，甲壳素与碱中 0H—的质量摩尔比为25-200:1，单位为克/摩尔。较好的，可以将甲壳素碱化静置后，经过过滤再洗涤至中性备用。过滤的方 法可以是脱脂纱布过滤，等等。这里洗涤至中性是指洗去吸附在甲壳素表面的碱， 从而使其置于水中呈中性，即PH为7左右。更好的，可以在甲壳素碱化后，用酸处理再静置洗涤至中性备用。所用酸为 可以是醋酸、柠檬酸、乙酸等弱酸。浓度为1-5M。经处理后，介质颗粒能够迅速沉淀，无絮状漂浮物，再已低浓度的醋酸洗脱 空柱时，洗脱液280nm吸光值应较小。本专利技术中，介质溶胀(即介质得率)计算方法为将一定质量介质经碱化，过 滤、洗净处理或经碱化，过滤、洗净，冰冻处理后，浸于蒸馏水，置量筒中自然沉 降12h，读取介质湿体积V，介质溶胀比率=V/介质质量。本专利技术中，介质收縮比率计算方法为将一定体积经充分溶胀的介质装柱，用 pH6. 40的0. 02MPBS平衡柱床后，计算柱体积Va，换用0. 1M醋酸溶液平衡柱床， 计算柱体积Vb，介质收縮比率=1-Vb/ Va。本专利技术中，介质相对流速比率测定方法为在0.05MPa压力下，测定单位时间 空床中O. lM醋酸溶液流速v"将相同体积各组介质装柱，使用O. 1M醋酸溶液平 衡柱床，在0. 05MPa压力下，测定单位时间各介质流速ve。介质相对流速比率=Vp/vu o本专利技术中，介质吸附容量比较方法为采用静态吸附法量取lml充分溶胀各组介质，加入3ml蒸馏水及lml的浓度为10mg/ml的鸡溶菌酶(c-LYZ)，混匀，待 稍沉降，取0. 5ml上清液，5000rpm离心10min，取0. 4ml上清液，用蒸馏水稀释 至2ml，测280，吸光度，记为A1;另将原液室温，静置6h后，5000rpm离心10min， 计算上清液体积V,取0. 5ml上清液，5000rpm离心10min，取0. 4ml上清液，用 蒸馏水稀释至2ml，静置6h，湖lj 280nm吸光度，记为A2， Af A,-A"介质的吸附容 量Qh力「 AAXVX介质溶胀比率。本专利技术中，甲壳素亲和介质吸水量计算方法为取真空低温冻干的甲壳素亲和 介质O. 05g，加入O. 5ml双蒸水，室温溶胀6h后，3000rpm离心30min，计算上清液体积，并计算单位质量甲壳素亲和介质吸水量。本专利技术中，介质得率计算方法将一定质量介质经碱化，过滤、洗净处理后， 浸于蒸馏水，置量筒中自然沉降12h，读取介质湿体积V,，介质溶胀比率-V,/介质 质量；将上述介质经O. 1M醋酸处理后，过滤、洗净，浸于蒸馏水，置量筒中自然 沉降12h，读取介质湿体积V2，介质得率=V2/介质质量。本专利技术中，介质的损耗比率=1_介质得率/介质溶胀比率。本专利技术中，介质的吸附容量Q—yJ AAXVX介质溶胀比率。另一方面，本专利技术提供了上述介质的制备方法，即将甲壳素在10-3(TC条件下 碱化3分钟-24小时后，静置并洗至中性。本专利技术的制备方法中，所用碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或者几种。所 用碱的浓度可以是1-IOM，用量可以是浴比1:5-20。本专利技术的制备方法中，碱化时间可以是6-18小时。例如，6小时，IO小时，12小时，15小时，18小时，等等。本专利技术的制备方法中，甲壳素与碱中0H—的质量摩尔比可以是25-200:1，单位为克/摩尔。本专利技术的制备方法中，甲壳素碱化静置后，经过过滤再洗涤至中性备用。本专利技术的制备方法中，反应温度为15-25'C。例如，15°C， 18°C， 20°C， 25°C 等等。也可以是10。C， 13°C， 28°C,， 3(TC等。本专利技术的制备方法中，甲壳素碱化后，用弱酸处理再静置洗涤。所用酸可以 是醋酸、柠檬酸、乙酸等弱酸。本专利技术的制备方法中，在酸处理时，加入甲壳素与酸中H+的质量摩尔比为 25-200:1，单位为克/摩尔。本专利技术中，未提及的反应条件可根据具体实验情况采用常规条件进行。本专利技术采用甲壳素为原料，制备分离纯化溶菌酶的亲和色谱介质。本专利技术采用 的制备方法简便易行，成本低廉；甲壳素亲和介质吸附性专一，流速较快；采用甲 壳素亲和介质纯化人溶菌酶，步骤简单高效，经过一次纯化，即可从发酵液中分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离溶菌酶的亲和层析介质，其特征在于，该层析介质是碱化后的甲壳素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余龙，黄鹏，李宗林，唐丽莎，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[]