用于胶质母细胞瘤的EGFR导向的CAR疗法制造技术

胶质母细胞瘤（GB）仍然是最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤；脑转移瘤，例如乳腺癌脑转移瘤（BCBM），也是具有侵袭性的并且与不良预后相关。嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞的过继转移已经成为有希望的抗癌方法，但是CAR工程化的细胞用于治疗脑癌的潜在应用还没有被研究。本发明专利技术提供了用于在各种癌症的治疗中使用表达CAR的细胞的组合物和方法，所述癌症包括脑癌，例如GB和BCBM。

EGFR guided CAR therapy for glioblastoma

Glioblastoma (GB) is still the most invasive primary malignant tumor of the brain; brain metastases, such as breast cancer brain metastases (BCBM), are also invasive and are associated with poor prognosis. Adoptive transfer of immune cells modified by chimeric antigen receptor (CAR) has become a promising anticancer method, but the potential application of CAR engineered cells to the treatment of brain cancer has not been studied. The present invention provides compositions and methods for using CAR-expressing cells in the treatment of various cancers, including brain cancers such as GB and BCBM.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于胶质母细胞瘤的EGFR导向的CAR疗法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年4月6日提交的美国临时申请号62/143,744的优先权，其全文以引用的方式合并入本文中。
技术介绍
脑癌是危险的并且难以治疗。胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GB）是最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤。大脑的癌症还造成风险，它是来自其他来源的转移的结果；例如在患有转移性乳腺癌的患者中乳腺癌脑转移瘤（BCBM）是常见的。即使使用化疗、放射和手术切除，GB患者的中位总生存期仅为14.6个月（Morgan,R.A.etal.(2012)HumGeneTher.23:1043-1053）。BCBM同样对可用的治疗具有较高的耐药性，并且对患者表现出不良的预后。常规的疗法通常缺少特异性，并且会对周围的脑实质和全身组织造成损害，这是限制其应用的因素（Imperato,J.P.etal.(1990)AnnNeurol.28:818-822）。对于GB的基于免疫的疗法是常规治疗的有希望的替代品，其具有产生可持续的抗肿瘤反应的潜在的长期效益，其有潜力靶定局部的和浸润性肿瘤细胞（Mellman,I.etal.(2011)Nature480:480-489）。表皮生长因子受体（EGFR）在包括GB的多种肿瘤中起到重要作用。EGFR是在GB中最常被扩增的基因，而其在正常脑组织中的表达是不可检测的或极低的（Parsons,D.W.etal.(2008)Science321:1807-1812；Salomon,D.S.etal.(1995)Crit.RevOncolHematol.19:183-232）。配体至EGFR的结合导致受体同源和异源二聚体形成、几个关键酪氨酸残基的自磷酸化，其导致几个细胞内下游信号通路的激活，这些通路包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PLCγ-PKC通路和PI3K/AKT通路，导致细胞增殖、运动和存活（Zandi,R.etal.(2007)CellSignal19:2013-2023）。EGFR扩增的肿瘤中的大约20-40%含有EGFR变异体III突变体（EGFRvIII），其包括在细胞外配体结合结构域中的外显子2-7的缺失（Aldape,K.D.etal.(2004)JournalofNeuropathologyandExperimentalNeurology63:700-707；Biernat,W.etal.(2004)BrainPathol.14:131-136；Fan,Q.W.etal.(2013)CancerCell24:438-449；Sugawa,N.etal.(1990)ProcNatlAcadSci.USA87:8602-8606）。该突变体形式在没有配体的情况下显示出组成性激活，从而激活肿瘤促进信号通路（Ohno,M.etal.(2010)CancerSci.101:2518-2524）。
技术实现思路
胶质母细胞瘤（GB）仍然是最具侵袭性的原发性脑部恶性肿瘤。嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞的过继转移已经成为有希望的抗癌方法，但是CAR工程化的自然杀伤（NK）细胞用于治疗GB的潜在应用还没有被研究。来自大约50%的GB患者的肿瘤表达野生型EGFR（wtEGFR），并且在较少的情况中表达wtEGFR和突变形式EGFRvIII；但是，先前报道的CART细胞仅集中于靶定EGFRvIII。本专利技术的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）抗原结合结构域；（b）铰链结构域；（c）跨膜结构域；和（d）细胞内结构域。本专利技术提供了一种新颖的CAR——一种表皮生长因子受体（“EGFR”）嵌合抗原受体（CAR），其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）识别野生型和/或突变的表皮生长因子受体（EGFR）（“wtEGFR和/或突变的EGFR”）两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域多肽；（c）共刺激多肽；和（d）CD3ζ信号传导结构域。在一个方面，所述共刺激分子包括细胞内结构域和跨膜结构域。非限制性的例子包括CD8、4-1BB共刺激信号传导区域、CD28共刺激分子、OX40、ICOS和CD27。在一个方面，所述抗EGFR抗体的抗原结合结构域包括抗EGFR重链（HC）可变区域和抗EGFR轻链（LC）可变区域。在进一步的方面，所述EGFRCAR进一步包括位于所述抗EGFRHC可变区域和所述抗EGFRLC可变区域之间的接头多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述CAR可以进一步包括可检测标签或纯化标记物。本文进一步公开了编码所述EGFRCAR及其补体的多核苷酸及其每个的等效物。本专利技术提供了含有所述多核苷酸和/或EGFRCAR的载体和宿主细胞。所述载体是质粒或载体。所述细胞可以是原核或真核细胞。在一个方面，所述细胞是T细胞或NK细胞。所述细胞可以被扩增，因此本专利技术进一步提供了所述细胞的被扩增的群体。在一个方面，所述细胞是细胞（例如T细胞）的被激活的群体。本专利技术进一步提供了这些组合物的诊断和治疗用途。例如，本专利技术提供了抑制细胞和/或肿瘤中的一个或多个的生长的方法，所述细胞和/或肿瘤在表达EGFR的细胞或干细胞的表面上表达wtEGFR或突变的EGFR、或wtEGFR和突变的EGFR，其中将这些细胞与有效量的包括本专利技术所述的EGFRCAR的分离的细胞接触。所述细胞可以是肿瘤细胞，例如胶质母细胞瘤或癌症干细胞，例如胶质母细胞瘤干细胞。所述接触可以是体外的或体内的。当在体外进行时，所述方法可用来筛选新的疗法或合并疗法。在体内，所述方法可用于治疗患有表达EGFR的癌症的患者，所述癌症例如脑癌，例如胶质母细胞瘤或另一种癌症（例如乳腺癌）在大脑中的转移瘤。在另一个方面，本专利技术提供了在有需要的对象中抑制以下中的一种或多种的生长的方法：在细胞的表面上表达wtEGFR或突变的EGFR、或wtEGFR和突变的EGFR的细胞。所述方法包括向所述对象施用有效量的包括本文所述的EGFRCAR的分离的细胞、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述表达EGFR的细胞可以是肿瘤细胞或癌症干细胞，例如胶质母细胞瘤或胶质母细胞瘤干细胞。所述表达EGFRCAR的分离的细胞对于接受该细胞的对象来说可以是自体同源的（eautologous）。本专利技术进一步提供了在有需要的对象中治疗癌症的方法，其中癌症细胞表达wtEGFR或突变的EGFR、或wtEGFR和突变的EGFR，其中向所述对象施用有效量的包括本文所述的EGFRCAR的分离的细胞。这些方法中的分离的细胞可以是NK细胞和/或T细胞，并且对于被治疗的对象来说可以是自体同源的。在进一步的方法，可以通过如由治疗医师所确定的任何合适的途径来施用所述细胞，包括但不限于颅内注射、静脉给药。本专利技术进一步提供了一种分离的复合物，其包括本文所述的EGFRCAR以及EGFR蛋白或其片段和/或突变的EGFR蛋白或其片段。在另一个方面，本专利技术提供了一种分离的复合物，其包括本文所述的EGFRCAR以及表达wtEGFR或突变的EGFR、或wtEGFR和突变的EGFR的细胞。本专利技术的进一步的方面涉及使用本文所述的表达EGFRCAR的细胞（例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）识别野生型和/或突变的表皮生长因子受体（EGFR）（“wtEGFR和/或突变的EGFR”）之一或两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域多肽；（c）共刺激分子或多肽；和（d）CD3ζ信号传导结构域，或其每个的等效物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.06 US 62/143,7441.一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）识别野生型和/或突变的表皮生长因子受体（EGFR）（“wtEGFR和/或突变的EGFR”）之一或两者的抗EGFR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域多肽；（c）共刺激分子或多肽；和（d）CD3ζ信号传导结构域，或其每个的等效物。2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述共刺激分子包括选自以下的分子或多肽：4-1BB共刺激信号传导区域、CD28共刺激分子、OX40、ICOS和CD27、或其每个的等效物。3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗EGFR抗体的抗原结合结构域包括抗EGFR重链（HC）可变区域和抗EGFR轻链（LC）可变区域、或其每个的等效物。4.根据权利要求3所述的CAR，其中所述HC可变区域包括：QVQLQQSGSEMARPGASVKLPCKASGDTFTSYWMHWVKQRHGHGPEWIGNIYPGSGGTNYAEKFKNKVTLTVDRSSRTVYMHLSRLTSEDSAVYYCTRSGGPYFFDYWGQGTTLTVSS、或其等效物。5.根据权利要求3或4所述的CAR，其中所述LC可变区域包括：DILMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHNNGITYLEWYLQRPGQSPKLLIYKVSDRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCFQGSHIPPTFGGGTKLEIKRAA、或其等效物。6.根据权利要求3所述的CAR，其进一步包括位于所述抗EGFRHC可变区域和所述抗EGFRLC可变区域之间的接头多肽。7.根据权利要求6所述的CAR，其中所述接头多肽包括GGGGSGGGGSGGGG、或其等效物。8.根据权利要求1至3的任一项所述的CAR，其进一步包括对EGFR结合结构域的氨基末端的信号多肽。9.根据权利要求1至3的任一项所述的CAR，其中所述铰链多肽包括CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG、或其等效物。10.根据权利要求2所述的CAR，其中所述CD28共刺激分子包括CD28跨膜结构域和CD28细胞内结构域、或其每个的等效物。11.根据权利要求1至3的任一项所述的CAR，其进一步包括连接至所述CAR的可检测标记物和/或纯化标记物。12.根据权利要求1至3、5或6的任一项所述的CAR，其中等效的多肽与该多肽具有至少80%的氨基酸同一性、或者由与编码该多肽或其补体的多核苷酸至少80%相同的或者在高度严格条件下与该多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸编码，其中所述高度严格条件包括：约25°C至约37°C的孵育温度；约6xSSC至约10xSSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4xSSC至约8xSSC的洗涤溶液。13.一种分离的核酸，其编码权利要求1至3、5或6的任一项所述的CAR。14.一种载体，其包括权利要求13所述的分离的核酸序列。15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体是质粒。16.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体是病毒载体。17.根据权利要求14所述的载体，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。18.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。19.根据权利要求14至18的任一项所述的载体，其进一步包括可检测标签和/或纯化标记物，其中所述可检测标签任选地不是天然存在的多核苷酸。20.一种分离的细胞，其包括权利要求1至3、5或6的任一项所述的CAR。21.一种分离的细胞，其包括权利要求13所述的分离的核酸。22.一种分离的细胞，其包括权利要求14所述的载体。23.根据权利要求20所述的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。24.根据权利要求21所述的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。25.根据权利要求22所述的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。26.根据权利要求23所述的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。27.根据权利要求24所述的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。28.根据权利要求25所述的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。29.根据权利要求26所述的分离的细胞，其中所述真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。30.根据权利要求27所述的分离的细胞，其中所述真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。31.根据权利要求28所述的分离的细胞，其中所述真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。32.根据权利要求29所述的分离的细胞，其中所述细胞选自T细胞和自然杀伤（NK）细胞。33.根据权利要求30所述的分离的细胞，其中所述细胞选自T细胞和自然杀伤（NK）细胞。34.根据权利要求31所述的分离的细胞，其中所述细胞选自T细胞和自然杀伤（NK）细...

【专利技术属性】
技术研发人员：余建华，迈克尔·卡里居里，
申请(专利权)人：余建华，迈克尔·卡里居里，
类型：发明
国别省市：美国,US