DNA聚合酶变体制造技术

本发明专利技术涉及：融合多肽，其在从N末端侧到C末端侧的方向包含1个或多个与PCNA结合的肽和具有DNA聚合酶活性的多肽；使用该多肽的核酸扩增法；含有该多肽的组合物和试剂盒。根据本发明专利技术，即使用Pol I型DNA聚合酶，在PCNA存在下的核酸扩增中，也能够在短时间内扩增长链DNA。

DNA polymerase variant

The invention relates to: fusion peptide, which includes 1 or more peptides combined with PCNA and a polypeptide with DNA polymerase activity from the end side of the N terminal to the C terminal side; a nucleic acid amplification method using the polypeptide; a composition and kit containing the polypeptide. According to the present invention, even if the Pol I DNA polymerase is used in nucleic acid amplification in the presence of PCNA, the chain DNA can be amplified in a short time.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA聚合酶变体
本专利技术涉及DNA聚合酶变体。本专利技术的DNA聚合酶变体特别是在PCNA存在下的核酸扩增中有用。
技术介绍
DNA聚合酶是能够在体外沿着作为模板的DNA链重新合成DNA链的酶，只要在该反应中，除了模板DNA以外，还存在作为引物的寡核苷酸和4种脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、和dTTP)，就会重新合成DNA链。DNA聚合酶被用于包括核苷酸测序和聚合酶链反应(PCR：polymerasechainreaction)在内的核酸扩增法等多个操作。作为提高DNA聚合酶的与DNA合成有关的诸多性质(延伸性、快速性、准确性等)的相关因子，从嗜热性古细菌(thermophilicarchaebacterial)中发现了各种蛋白。作为相关因子，例如分离了来自Pyrococcusfuriosus(激烈热球菌)的多种蛋白(专利文献1)。另外，作为相关因子，还由ThermococcuskodakarensisKOD1株分离了PCNA(增殖细胞核抗原：proliferatingcellnuclearantigen)、RFC-S(复制因子C小亚单元：replicationfactorCsmallsubunit)、或RFC-L(复制因子C大亚单元：replicationfactorClargesubunit)(专利文献2)。PCNA作为同聚体形成被称作“滑动钳(slidingclamp，滑卡)”的环状结构，促进DNA合成反应。PCNA在酵母～人中高度保存，在真核细胞中PCNA在细胞分裂、DNA复制、修复、细胞周期调节、或DNA甲基化和染色质重建这样的复制后修饰中起到重要作用。RFC(复制因子C：replicationfactorC)是由5个亚单元构成的蛋白复合体，且由于其将PCNA装载至DNA中的功能，还将RFC称作“钳载体(clamploader，装卡器)”。另外，RFC与Escherichiacoli(大肠杆菌)的γ复合体(γComplex)同等。对RFC的作为钳载体的功能进行说明如下：(1)RFC与DNA链结合；(2)利用通过ATP的水解而产生的能量，RFC使环状PCNA开裂；(3)PCNA夹持DNA链；(4)进一步水解ATP，由此RFC从DNA上解离，而使PCNA与DNA结合。除DNA聚合酶和RFC以外，PCNA还与各种蛋白形成复合体，参与DNA的修复和复制及其他基因调节功能。已知人体内至少有12个蛋白与PCNA结合。各蛋白经由PIP盒(PIPbox：PCNA相互作用蛋白盒)与PCNA结合，从而所述蛋白留置在DNA链上。已经明确：PIP盒中存在一些同源性高的氨基酸序列、以及一些蛋白经由PIP盒位点与PCNA结合(非专利文献1)。如上所述，在自然界中PCNA和RFC协同发挥作用，从而进行DNA复制。其中，利用特别是起到核心作用的PCNA，尝试进行了提高PCR的效率。PCR中广泛使用的、来自嗜热性真细菌(thermophiliceubacteria)Thermusaquaticus(水生栖热菌)的家族A(PolI型)DNA聚合酶(还称作“Taq聚合酶”)不与PCNA发生相互作用。然而，据报道，为了使与家族B(α型)DNA聚合酶具有相同形式，而使包含来自Archaeoglobusfulgidus(闪烁古生球菌)的PolB的PIP盒的50个氨基酸与Taq聚合酶的C末端融合而成的嵌合融合蛋白(嵌合Taq)在来自A.fulgidus的PCNA存在下扩增DNA。然而，当所扩增的DNA的大小为5kb时，归于合成物的条带变浅，因此在延伸性方面还存在一些弊端(非专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1：WO1999／00506专利文献2：日本特开2002-360261号公报非专利文献非专利文献1：GenestoCells,7(9),911-922(2002)非专利文献2：J.Biol.Chem.,277(18),16179-16188(2002)。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题如上所述，在现有技术中很难说能够提供满足延伸性、快速性、和准确性等所有的各种性质的DNA聚合酶。本专利技术想要解决上述现有的家族A(PolI型)DNA聚合酶的问题，其目的在于：提供更便利且容易使用、具有优异的延伸性和快速性的DNA聚合酶和使用该聚合酶的核酸扩增法。用于解决课题的手段本专利技术人以提供可用于在PCNA存在下的核酸扩增的新型家族A(PolI型)DNA聚合酶为目的，反复进行了深入研究，结果发现：通过使用在从N末端侧到C末端侧的方向包含与PCNA结合的1个或多个肽和具有DNA聚合酶活性的多肽的融合多肽，PCNA存在下的核酸扩增反应得到促进，从而完成了本专利技术。对本专利技术进行概述，本专利技术涉及下述的[1]～[16]：[1]融合多肽，其在从N末端侧到C末端侧的方向含有：a)1个或多个与PCNA结合的肽；以及b)具有DNA聚合酶活性的多肽；[2][1]所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽为包含PIP盒的肽；[3][2]所述的融合多肽，其特征在于：所述PIP盒是由序列表的SEQIDNO:52～91中所示的任一个氨基酸序列构成的肽；[4][1]或[2]所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是包含来自DNA聚合酶相关因子的PIP盒的肽；[5][1]、[2]和[4]的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是包含来自复制因子C大亚单元的PIP盒的肽；[6][1]、[2]、[4]和[5]的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是序列表的SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列、或者是包含上述氨基酸序列的肽；[7][1]～[6]的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述融合多肽在与PCNA结合的肽和具有DNA聚合酶活性的多肽之间包含5～50个氨基酸的连接肽(linkerpeptide，接头肽)；[8][7]所述的融合多肽，其特征在于：所述连接肽是由丝氨酸和甘氨酸构成的氨基酸序列；[9][1]～[8]的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述具有DNA聚合酶活性的多肽是PolI型DNA聚合酶或其片段；[10][1]～[9]的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述具有DNA聚合酶活性的多肽是TaqDNA聚合酶或其片段；[11]核酸，其编码[1]～[10]的任一项所述的融合多肽；[12]核酸扩增用组合物，其含有[1]～[10]的任一项所述的融合多肽；[13][12]所述的核酸扩增用组合物，其进一步含有PCNA；[14]试剂盒，其含有[1]～[10]的任一项所述的融合多肽；[15][14]所述的试剂盒，其进一步含有PCNA；[16]与模板DNA互补的DNA的制造方法，其特征在于：使用含有[1]～[10]的任一项所述的融合多肽和PCNA的组合物。专利技术效果根据本专利技术，即使是PolI型DNA聚合酶，在PCNA存在下，也能够在短时间扩增长链DNA。附图说明[图1]图1是关于实施例1中的TaqDNA聚合酶变体的纯化的、SDS-PAGE凝胶的照片。通过SDS-PAGE的分析确认了Taq81～Taq85的纯度。[图2]图2是关于实施例1中的TaqDNA聚合酶变体的纯化的、SDS-PAGE凝胶的照片。通过SDS-PAGE的分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 融合多肽，其在从N末端侧到C末端侧的方向包含：a) 1个或多个与PCNA结合的肽；以及b) 具有DNA聚合酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.27 JP 2015-2319741.融合多肽，其在从N末端侧到C末端侧的方向包含：a)1个或多个与PCNA结合的肽；以及b)具有DNA聚合酶活性的多肽。2.权利要求1所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽为包含PIP盒的肽。3.权利要求2所述的融合多肽，其特征在于：所述PIP盒是由序列表的SEQIDNO:52～91的任一个中所示的氨基酸序列构成的肽。4.权利要求1或2所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是包含来自DNA聚合酶相关因子的PIP盒的肽。5.权利要求1、2和4的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是包含来自复制因子C大亚单元的PIP盒的肽。6.权利要求1、2、4和5的任一项所述的融合多肽，其特征在于：所述与PCNA结合的肽是序列表的SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列、或者是包含上述氨基酸序列的肽。7.权利要求1～6的任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：石野良纯，石野园子，山上健，上森隆司，高津成彰，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP