采用多种单一标记探针使单个mRNA分子成像方法技术

本发明专利技术提供了一种在固定化、通透化的细胞中探测信使核糖核酸(mRNA)分子的靶序列的方法，所述的靶序列包括至少30个具有15‑100个核苷酸的非重叠探针结合区，该方法包括：将所述细胞浸入在过量的、核酸杂交的至少30种探针中，每种探针都用相同的荧光标记物单一标记，并且每种探针都含有与靶序列的不同探针结合区互补的核酸序列；清洗所述固定化细胞以去除非结合探针；检测所述探针发出的荧光。

Single mRNA molecular imaging using multiple single labeled probes

The present invention provides a method for detecting target sequences of messenger ribonucleic acid (mRNA) molecules in immobilized and permeable cells. The target sequence includes at least 30 non overlapping probe binding regions with 15 nucleotides and 100 nucleotides, which includes: immersing the cell in an excess of at least 30 probes of nucleic acid hybridization. Each probe is labeled with the same fluorescent marker, and each probe contains nucleic acid sequences that complement each other with the different probes of the target sequence; cleaning the immobilized cells to remove unbound probes; and detecting the fluorescence emitted by the probe.

【技术实现步骤摘要】
采用多种单一标记探针使单个mRNA分子成像方法本申请为申请号为200980135364.8，申请日为209年9月10日，专利技术名称为“采用多种单一标记探针使单个mRNA分子成像方法”的分案申请。与在先申请的关系本申请要求2008年9月10日提交的美国临时申请61/191,724的优先权，在此以其全文通过引用并入本文。
本专利技术通常涉及核酸序列的检测方法。
技术介绍
人们越来越清晰地认识到，基因在个体细胞中的表达可明显偏离细胞群体的平均水平，非常需要能提供个体细胞mRNA精确计数拷贝数目的新方法。更理想的方法同时还能揭示mRNA的细胞内的定位，因为mRNA的位置也常被细胞用来从空间上限制基因活性。显微镜分析之后的原位杂交是一种已为人们认可的研究基因表达的方法。第一代原位杂交是用放射活性探针实现的。早期的改进涉及将探针连接到催化显色反应或荧光反应的酶上。然而，由于这些反应的产物是小分子或沉淀物，可从探针弥散出去，因此不能准确定位靶分子。相反，直接用数个荧光分子标记的探针保持了空间分辨率，但所能实现的敏感性相对较差。罗伯特·森格(RobertSinger)及其同事开发了一种原位杂交方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在固定化、通透化的细胞中检测单独信使RNA(mRNA)分子的第一靶序列的方法，所述方法包括以下步骤：将所述固定化、通透化的细胞浸入在含过量的第一组至少12条非重叠核酸杂交探针的杂交溶液中，所述非重叠核酸杂交探针具有与所述第一靶序列互补的核酸序列，长7‑30个核苷酸并且用第一颜色的相同荧光团的一个分子标记；清洗所述固定化的细胞以去除未结合的探针；和检测所清洗的细胞中与所述第一靶序列对应的所述第一颜色的点。

【技术特征摘要】
2008.09.10 US 61/191,7241.一种在固定化、通透化的细胞中检测单独信使RNA(mRNA)分子的第一靶序列的方法，所述方法包括以下步骤：将所述固定化、通透化的细胞浸入在含过量的第一组至少12条非重叠核酸杂交探针的杂交溶液中，所述非重叠核酸杂交探针具有与所述第一靶序列互补的核酸序列，长7-30个核苷酸并且用第一颜色的相同荧光团的一个分子标记；清洗所述固定化的细胞以去除未结合的探针；和检测所清洗的细胞中与所述第一靶序列对应的所述第一颜色的点。2.如权利要求1所述的方法，其中所述组的探针具有长度为15-30个核苷酸的靶互补序列。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述探针组包括至少24条探针。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述探针组包括至少30条探针。5.如权利要求4所述的方法，其中所述检测步骤包括用荧光显微镜成像。6.如权利要求1或5所述的方法，其中所述检测步骤包括使所述清洗的固定化细胞成像从而显示第一可检测标记物的点，对所述图像进行处理以加强所述点，和利用强度阈值分析所述经加强的点，其中在所述强度阈值时点的数量对阈值不敏感。7.如权利要求6所述的方法，其中通过使用三维线性拉普拉斯高斯滤波器过滤图像而对所述图像进行处理。8.如权利要求1所述的方法，其中所述杂交溶液包含过量的第二组至少12条非重叠核酸杂交探针，所述非重叠核酸杂交探针具有与第二RNA靶序列互补的序列，长度为7-30个核苷酸并且用相同的第二荧光团的一个分子标记，所述第二荧光团可与所述第一荧光团区分。9.用于测定测试化合物是否影响细胞中信使RNA分子的第一靶序列的分布的量的方法，所述方法包括：将所述细胞与所述测试化合物温育足以引发响应的时间；使所述细胞通透化；将所述通透化细胞浸入在含过量的第一组至少12条非重叠核酸杂交探针的杂交溶液中，所述非重叠核酸杂交探针具有与所述第一靶序列互补的核酸序列，长7-30个核苷酸并且用相同的第一荧光团的一个分子标记；清洗所述细胞以去除未结合的探针；检测所述第一荧光团的分布的量；和...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿均·拉吉，桑杰·泰尔吉，
申请(专利权)人：新泽西鲁特格斯州立大学，
类型：发明
国别省市：美国,US