一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品采集；步骤（2）、稀释样品；步骤（3）、洗脱细胞；步骤（4）、收集滤液；步骤（5）、收集沉淀物；步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定；步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定；步骤（8）、肉鸡盲肠淀粉降解细菌的菌丰度的确定及统计分析。本发明专利技术不仅可以快速获取肉鸡盲肠中的优势淀粉水解细菌组成的原位信息，还可以用来筛选优质的肉鸡饲料配方，为进一步调控盲肠淀粉发酵对肉鸡生产性能和健康的影响具有重要的意义。

A method for rapid detection of starch degradation bacteria in caecum of Broilers

The present invention relates to a rapid detection method for broiler cecum starch degradation bacteria, including steps: step (1), sample collection; step (2), dilution sample; step (3), eluant; step (4), collection filtrate; step (5), collect sediment; step (6), and cecum starch degrading bacteria Calibration; step (7), identification of the cecum starch degrading bacteria; step (8), determination and statistical analysis of the abundances of bacteria in broiler cecum starch degrading bacteria. The invention can not only quickly obtain the in situ information of the dominant starch hydrolysate in the broiler checum, but also can be used to screen the high quality chicken feed formula, which is of great significance for further regulating the effect of the fermentation of the cecum starch on the performance and health of broilers.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法
本专利技术涉及一种快速检测淀粉降解细菌的方法，尤其是一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法。
技术介绍
动物饲料效率是评估现代肉鸡营养和能量代谢功效的重要指标之一。提高饲料效率可以降低生产者的成本，为人类生产更多的食用资源，减少排泄物和温室气体的排放。饲料转化率和残留饲料摄取量是评估动物饲料效率的主要指标。饲料效率是一个复杂的特征，因为它不仅受宿主遗传学和生理状态的影响，而且还受到肠道微生物菌群的影响，因为肠道微生物菌群会影响宿主的营养消化和能量吸收。大约70％的肉鸡生产成本和饲料成本联系在一起，对廉价饲料原料的追求是永无止境的。肉鸡拥有健康的肠道不仅可以提高饲料营养的消化吸收率，而且能够抵抗肠道致病菌的侵袭，减少因疾病死亡和并发症造成的经济损失，是肉鸡发挥良好生产性能的关键因素。谷物淀粉占饲粮的70％-80％，是肉鸡生长的主要能量来源，饲粮淀粉在肉鸡肠道中的消化率和淀粉颗粒的结构和组成、淀粉颗粒和蛋白质的相互作用以及饲料加工后颗粒的可用性相关。因为淀粉是肉鸡日粮中的主要能量成分，任何能够减少不消化淀粉的策略都会对肉鸡的生产能力有益。虽然总体上肉鸡肠道对淀粉的消化能力良好，饲粮谷物淀粉消化率相对较高，90％糖以及淀粉在肉鸡胃肠道(GIT)中消化，然而多种相互关联的因素都会降低肉鸡淀粉的全肠道和后肠消化率，主要的因素包括：淀粉的结构特点、淀粉的颗粒性状、饲粮中的可溶性纤维和不可溶纤维的浓度以及肉鸡的基因族源。胃肠道是肉鸡淀粉消化和吸收的主要部位，肠道十二指肠对淀粉消化吸收至关重要，它具有比后肠更低的pH值，是吸收大部分葡萄糖和小肠内其他营养物质的区域。然而最近新一代DNA测序研究表明，除了胃肠道是肉鸡淀粉消化和吸收的主要部位之外,盲肠微生物菌群也参与了肉鸡淀粉的代谢。肉鸡盲肠由于位于肉鸡肠道后段而常常被忽视，流入盲肠的10％未消化饲粮淀粉在盲肠的发酵代谢也因此常常被忽略，大多数研究都集中在如何改善肉鸡肠道中淀粉的消化率，减少饲粮中未经消化淀粉流入盲肠的数量。近年来随着Omics技术的应用和发展，大量的研究通过宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质学确定了盲肠微生物群落的组成，预测了微生物群落的功能，了解和比较了盲肠微生物菌群的信息。由于充满了发酵微生物的盲肠在肉鸡预防病原体定殖，解毒有害物质，回收氮气和吸收额外的营养物质中起着重要作用，因此盲肠微生物菌群在肉鸡代谢疾病中的重要性受到越来越多的关注。肉鸡肠道健康优化对于精准饲养和精准营养是非常重要的，微生物发酵的代谢产物对肠道健康有直接影响，肉鸡肠道微生物群落和宿主的养分和流体吸收、免疫调节、抵御感染、向大脑传送信号、维持体内的平衡和生长、繁殖有关。在饲料，微生物群落和宿主之间的三角关系中，处于最佳状态的肠道健康对于肉鸡的生产性能是最关键的因素。最新的研究结果表明盲肠是肉鸡胃肠道GIT发酵的主要部位，40％饲粮中未经消化的淀粉(包括植物颗粒和动物颗粒)流入盲肠，靠盲肠微生物菌群降解，转化为微生物需要的养分-短链脂肪酸(SCFA)和气体，为盲肠细菌的发育和生长提供能量，调整肠道健康环境，导致盲肠微生物向有益于改善肠道健康的方向发展，帮助宿主提高了免疫系统的发育，增强宿主肠道的结构和强度(Jamroz等，2002)。盲肠微生物能够利用宿主消化系统中未能利用的饲粮成分，从而改善饲粮的总能量捕获。实验研究证明,切除盲肠的肉鸡的粗纤维代谢和其他营养物质的消化率比正常肉鸡低；另外，在盲肠中观察到较强的葡萄糖吸收能力，与空肠相比，盲肠在糖浓度较低的状况下，具有较高的吸收糖的能力。与肉鸡其他胃肠道部分相比，盲肠中短链脂肪酸(SCFA)的浓度最高。在最近肉鸡盲肠宏基因组的研究中，已经观察到许多寡糖和多糖降解酶编码基因和涉及短链脂肪酸(SCFAs)产生的几种途径，SCFA主要通过盲肠微生物发酵产生，宿主可以通过粘膜吸收进行分解代谢产生能量，产生的SCFAs通过降低pH来抑制宿主肠道中的酸敏感病原体。短链脂肪酸不仅可以抑制宿主病原菌的生长，同时在吸收之后向宿主提供一些产生能量的底物。盲肠中的微生物菌群与宿主的相互作用导致了不同的饲料效率的差异。首先，宿主基因改变肠道生理环境，使它成为微生物的“底物”，而且“底物”的变化会影响肠道微生物组成；反过来肠道微生物菌群的代谢又影响“底物”的组成；最后盲肠微生物菌群与宿主的相互作用就通过宿主的饲料效率表现出来。近期研究表明，宿主的代谢免疫功能随着盲肠微生物菌群组成和丰度的变化而变化，揭示了盲肠微生物菌群在动物饲料效率方面的重要影响。饲粮中碳水化合物消化率的水平是确定进入后肠的碳水化合物的数量重要的因素，而这些碳水化合物是盲肠微生物发酵的底物，进入盲肠的未经消化的碳水化合物将引起微生物群落结构的瞬态变化。在观察商业肉鸡养殖场的饲料转化效率时，发现一旦肉鸡小肠中的消化和营养摄取出现障碍，未经消化的饲粮碳水化合物进入盲肠的量上升，导致基于简单底物的微生物菌群的活化，盲肠中乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度增加(andApajalahti，2013)。一直以来，通过特定的肠道功能菌群来监控肉鸡肠道微生物菌群的变化，对维持肠道健康进而提高肉鸡生产性能是有效的策略，人们对将某些盲肠功能菌群与肉鸡的健康和生产性能联系起来一直很感兴趣。水解是淀粉分解发酵的第一步，到目前为止，关于肉鸡盲肠淀粉水解细菌的信息很少，只有很少的纯培养研究结果揭示了盲肠中的淀粉水解细菌包括乳酸菌属(Lactobacillusspp.)、双歧杆菌属(Bifidobacteriumspp.)，梭菌属(Clostridiumspp.)；证明了这些细菌能分泌α-amlase并参与淀粉的降解。至今为止这些研究结果都没有在原位(insitu)(不需要通过纯培养分离菌株)状态下得到证实。由于盲肠中仅有20％的细菌能在培养基中生长，而且通过纯培养研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能。近期大量的研究通过Omics技术(宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学)对肉鸡盲肠中的微生物群落进行了分析，发现盲肠微生物与饲料效率高度相关，研究结果表明了盲肠微生物菌群在肉鸡饲料效率方面的突出作用，特别是乳酸菌属(Lactobacillusspp.)在影响肉鸡饲料效率方面起主要作用，其他盲肠微生物发挥次要的作用。这些近期的研究结果为通过调节盲肠功能微生物来提高肉鸡饲料效率提供了一个有希望的前景，研究结果进一步指出应该更多地关注迄今为止尚未得到充分研究的盲肠微生物菌群，并且通过盲肠微生物菌群来改善肉鸡的健康和营养。由于微生物纯培养技术的局限性，研究肉鸡盲肠微生物菌群的变化及探讨饲粮组成变化对盲肠微生物功能菌群的影响受到了限制。虽然现代分子生物学技术-Omics技术(包括宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学)结合动物模型及生物信息学已经被广泛用于分析肉鸡盲肠功能菌群的组成和功能对肉鸡健康和生产性能的影响，但是由于Omics技术过程复杂，费用昂贵，需要专业技能较强的操作分析人员，至今为止，这项技术还没有广泛应用于鉴定和定量肉鸡盲肠淀粉水解细菌。提高动物饲料效率是动物营养中的一个重要问题，因为需要减少饲养场的环境污染，降低生产成本。肉鸡的饲料效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；步骤（2）、稀释样品：称取大约10 g 步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液, 混匀；步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad 匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后, 用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中,得到细胞悬浮液，待用；步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定取上述细胞悬浮液转入到无菌离心管中，离心；去除上清液，加入1×Tris‑HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液, 立即将混合液体转入到无菌血清瓶中，随后加入灭菌后的电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光,记录每一个淀粉降解细菌的位置；步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；步骤（8）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI 染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20‑30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2‑3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；步骤（9）、盲肠淀粉降解细菌的丰度的确定及统计分析。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测肉鸡盲肠淀粉降解细菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，将清洗干净的盲肠放在灭菌锡纸上，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；步骤（2）、稀释样品：称取大约10g步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液,混匀；步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后,用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中,得到细胞悬浮液，待用；步骤（6）、盲肠淀粉降解细菌的标定取上述细胞悬浮液转入到无菌离心管中，离心；去除上清液，加入1×Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光淀粉染液,立即将混合液体转入到无菌血清瓶中，随后加入灭菌后的电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光,记录每一个淀粉降解细菌的位置；步骤（7）、盲肠淀粉降解细菌的回位鉴定清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；步骤（8）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔云虹，夏云，念馨，张旭祥，赵亚南，瞿越云，殷根深，
申请(专利权)人：孔云虹，
类型：发明
国别省市：云南,53