一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法技术

本发明专利技术涉及一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法，应用益生菌枯草芽孢杆菌和Cu2+共同发酵，通过逐步提高CuSO4浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，获得枯草芽孢杆目标菌株NT66。采用的逐步提高Cu2+浓度的方法驯化枯草芽孢杆菌，能够显著地提高枯草芽孢杆菌的耐受性，增加了菌体的含铜量。通过优化培养基、发酵条件，获得枯草芽孢杆菌铜产品，不仅提高了菌体发酵过程中产生的酶、氨基酸以及小肽等活性物质，而且提高枯草芽孢杆菌富集铜的量。制备的枯草芽孢杆菌铜不仅拥有枯草芽孢杆菌的优点，而且将无机铜转化成菌体有机铜，大大提高了动物对微量金属元素的利用率，更好地发挥有机铜的生物学功能。

A Bacillus subtilis rich in copper and its cultivation method

The present invention relates to a kind of Bacillus subtilis rich in copper and its culture method. The bacterium Bacillus subtilis and Cu2+ are fermented together. The Bacillus subtilis is domesticated by the method of increasing the concentration of CuSO4, and the target strain NT66 of the Bacillus subtilis is obtained. The method of increasing Cu2+ concentration gradually tamed Bacillus subtilis can significantly increase the tolerance of Bacillus subtilis and increase the copper content of the bacteria. By optimizing the culture medium and fermentation conditions, the copper product of Bacillus subtilis was obtained, which not only improved the enzyme, amino acid and small peptide and other active substances produced in the fermentation process, but also increased the amount of copper enriched with Bacillus subtilis. The preparation of Bacillus subtilis not only has the advantage of Bacillus subtilis, but also transforms the inorganic copper into the organic copper of the fungus, which greatly improves the utilization rate of the trace metal elements and better functions the biological function of the organic copper.

【技术实现步骤摘要】
一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法
本专利技术属畜禽微生态制剂生产
，具体涉及一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法。
技术介绍
枯草芽孢杆菌作为肠道益生菌，它能迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌的生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，抑制致病菌的生长，刺激免疫器官的生长，提高机体免疫力，提高生长速率。另一方面，枯草芽孢杆菌能够吸附二价金属阳离子，常被用于处理重金属环境污染问题；然而，目前该菌种的应用只考虑肠道微生态的效果，没有兼顾微量元素的“富集”能力，极大地限制了市场的发展空间。因此，开发一种融合枯草芽孢杆菌多种功能的产品，对满足不同消费群体的需要具有重要的社会意义。众所周知，一定浓度的铜能促进动物的生长发育，但在饲料中添加高剂量的铜，铜的利用率低，造成近35％左右的铜排除体外，对自然生态环境和水造成污染，尤其是现代规模化畜禽养殖，排放到环境中的铜的含量很高，会造成水体富营养化，并使动物和植物产品造成残留，从而危及整个生态环境。因此，探究一种既满足动物生长，又能够减少铜排放量的方法，对畜牧绿色发展和维护生态良好循环具有重要社会价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种富含铜的枯草芽孢杆菌及其培养方法，该菌株能够作为动物饲料添加剂，既能满足动物对铜的需要量，又能提高饲料利用率。本专利技术首先提供一种富含铜的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15329。所提供的枯草芽孢杆菌NT66株可以用作制备饲料添加剂。本专利技术再一个方面提供一种提高枯草芽孢杆菌中有机铜含量的培养方法，是在富含铜培养基中接种耐铜离子的枯草芽孢杆菌种后，在27～36℃培养，转速150～250r/min。使菌种传代18～25次，在收集发酵的菌株。优选是在32.7℃培养时间48h；转速180r/min。培养基的配方最终铜离子的浓度为40-55mg/L。其中培养基的一种具体配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl3g/L，葡萄糖7.53g/L，Cu2+浓度51.2mg/L，pH值6.08。与现有技术相比，本专利技术方法具有如下优点：1、获得了高耐受铜的菌种：本专利技术驯化后的菌能够耐受高浓度的Cu2+，并且能够稳定的生长。2、所获得菌株具有能补铜和促进饲料利用率双重功效。本专利技术弥补了无机铜和单一菌种的缺陷。能够将无机铜大部分转化成有机铜，不仅能够达到补铜作用，更能增强动物免疫力，提高饲料利用率。3、工艺简单安全，可操作性强，成本低。所获得的菌株具有能在肠道内生长、分泌酶和维生素、促进肠道各种消化酶活性、抑制有害菌等作用。另外，本专利技术在进行发酵时操作工艺简便，规模可大可小，适合推广，并且成本较低。附图说明图1：驯化对枯草芽孢杆菌红外光谱吸收峰的影响图；图2：菌体含量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；图3：菌体含量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌的影响图；图4：菌体含量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；图5：菌体铜含量响应面中温度与pH值交互对枯草芽孢杆菌铜的影响图；图6：菌体铜含量响应面中温度与葡萄糖浓度交互对枯草芽孢杆菌影响图；图7：菌体铜含量响应面中葡萄糖浓度与pH交互对枯草芽孢杆菌铜影响图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面通过实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本专利技术的实施例是用于解释本专利技术而不是对本专利技术的限制。本专利技术应用益生菌枯草芽孢杆菌和Cu2+共同发酵，通过驯化枯草芽孢杆菌获得了富含铜的菌株，且能够稳定的生长。同时优化培养基、发酵条件，不仅提高了菌体发酵过程中产生的酶、氨基酸以及小肽等活性物质，而且提高枯草芽孢杆菌富集铜的量。所筛选的菌株应用于动物饲料中，可以起到促进肠道消化、提高饲料利用率等作用。虽然酵母菌和枯草芽孢杆菌在动物肠道中均属于过路菌，但是枯草芽孢杆菌属于耗氧菌，能够抑制肠道有害菌繁殖，耐胃酸胆盐强；因此，利用枯草芽孢杆菌吸附二价金属离子的功能特点，开发一种富含铜的枯草芽孢杆菌产品具有重要的经济价值。本专利技术的方法经过筛选的富铜枯草芽孢杆菌，并优化枯草芽孢杆菌的培养条件后，得到的枯草芽孢杆菌铜菌种不仅能够保证获得较多枯草芽孢杆菌的同时，还可以富集较多的铜；其中，当铜添加量为52.1mg/L时，菌体含量为0.46g/L，菌体的有机铜含量为2906.34mg/kg；然而，照搬酵母铜的制备方法来获得枯草芽孢杆菌铜菌株无法得到上述的理想效果。本专利技术的枯草芽孢杆菌的筛选步骤如下：1)菌种的驯化：利用微生物能逐渐适应不利生长环境因素的特性，采用逐步提高培养基中Cu2+浓度的方式进行驯化，培养若干代后，最终获得能够耐受高浓度Cu2+的菌种，并将该菌种进行斜面保藏，4℃储藏备用。2)确定目标菌种：将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等进行分析，筛选确定目标菌种，并确定能够进行稳定传代。本专利技术的枯草芽孢杆菌的培养方法如下：1)发酵平衡点的确定：根据该菌种的生长特性以及对Cu2+的耐受能力，以菌体含量和菌体铜含量为最终衡量指标。2)培养基及培养条件的优化：通过单因素试验优化葡萄糖、pH、培养温度、转速、接种量等含量，初步获得枯草芽孢杆菌铜菌种的培养条件。3)响应面分析：根据单因素试验结果，通过响应面分析确定枯草芽孢杆菌铜的培养条件。4)枯草芽孢杆菌铜的制备：在最终优化的培养条件下，枯草芽孢杆菌经过发酵一定时间，离心、除去培养基中无机铜及其他成分后即得枯草芽孢杆菌铜菌种的湿样，经55℃烘干后，检测含量，得到枯草芽孢杆菌铜产品。枯草芽孢杆菌铜的制备参数为：①培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉7g/L，NaCl3g/L，葡萄糖7.53g/L，Cu2+浓度51.2mg/L，pH值6～8；②培养条件：接种量1～3％，培养温度24～36℃，培养时间24～56h，转速150～250r/min。③目标菌种传代18～25次。当Cu2+的添加量为51.2mg/kg时，最终获得的枯草芽孢杆菌铜的菌体含量为0.43g/L，菌体有机铜含量2906.34mg/kg。下面结合具体实施案例对本专利技术方法进行详细描述。实施例1：富含铜枯草芽孢杆菌的筛选1、本专利技术步骤如下：1)菌种的筛选：采用逐步提高培养基中Cu2+浓度的方式进行驯化；将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌性质特点，并且能够稳定传代，最终获得能够耐受高浓度硫酸铜(300mg/L)的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株，于2018年1月31日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15329。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NT66株与出发菌株的活性物质变化情况见表1，表2。由表1可知，经过传代20次驯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富含铜的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCC No.15329。

【技术特征摘要】
1.一种富含铜的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCCNo.15329。2.权利要求1所述的菌株在制备饲料添加剂中的应用。3.一种提高枯草芽孢杆菌中有机铜含量的培养方法，其特征在于，所述的方法是在富含铜离子的培养基中接种耐铜的枯草芽孢杆菌种后，在27～36℃培养，转速150～240r/min。使菌种传代18～25次后，再收集发酵的菌株。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是在32.7℃培养48h；转速1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝维，刘国栋，黄燕萍，葛文华，张名爱，岳斌，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37