一种哈夫尼菌YYBIO-001及其制备方法、应用和菌剂技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种哈夫尼菌YYBIO‑001及其制备方法、应用和菌剂，保藏号CGMCC No.145028，能显著促进植物生长并且拮抗多种植物病原真菌。本发明专利技术的哈夫尼菌YYBIO‑001由甘蔗植株样品中分离筛选获得，具有生态安全。本发明专利技术所述的Hafnia sp.菌株具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用。本发明专利技术菌株可应用于生产具有促生的固氮微生物菌剂和生物有机肥，对于减少化肥农药的使用、保护生态环境具有重要意义，并有广阔的应用前景。

A kind of YYBIO-001 and its preparation, application and inoculant

The invention relates to the field of microbial technology, in particular to a YYBIO 001, a preparation method, an application and a bacterial agent, and the preservation number CGMCC No.145028, which can significantly promote plant growth and antagonize a variety of plant pathogenic fungi. The YYBIO 001 of the new strain is obtained from sugarcane plant samples and has ecological safety. The Hafnia sp. strain of the invention has the function of combining nitrogen fixation and secreting auxin to promote plant growth. The strain of the invention can be applied to the production of nitrogen fixing microbial agent and bio organic fertilizer, which is of great significance for reducing the use of chemical fertilizer and pesticide and protecting the ecological environment, and has a broad application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种哈夫尼菌YYBIO-001及其制备方法、应用和菌剂
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种哈夫尼菌YYBIO-001及其制备方法、应用和菌剂。
技术介绍
食糖是国家重点保护的战略物质，甘蔗是我国最主要的产糖作物。探索对甘蔗生产有促进作用的新技术无疑对保障我国食用糖安全具有重大意义。高等植物体内常有内生微生物，其中一类内生菌具有生物固氮功能，可将空气中的氮气转化为氨，减轻植物对化学合成氮肥的依赖。虽然很多植物体内有内生固氮菌，但固氮效果强的只有含糖量高的甘蔗和甜菜，这是因为细菌固氮时需要植物提供充足的能量，蔗糖就是最合适的能量物质之一。巴西种植甘蔗已有几十年甚至几百年的历史，蔗田施氮量一直不高但却能维持甘蔗持续高产，并且土壤氮储量也不下降，其中主要得益于甘蔗的生物固氮作用。DeBary于1886就发现植物内生菌，1977年Bacon等人证实牛吃过量的高羊茅草后中毒是高羊茅的内生真菌引起，这引起了人们对内生菌研究的兴趣。大量研究表明，甘蔗体内有多种内生固氮菌，在适宜条件下这些固氮菌可在甘蔗根、茎、叶内进行固氮作用且不形成特异结构，为甘蔗生长提供氮源。70年代起，巴西、印度、南非、澳大利亚和中国等蔗糖生产大国对甘蔗联合固氮进行了大量研究。鉴于根际联合固氮受根际环境中其它微生物的干扰较大，固氮效果难以保证，因此科学家同时开展了对内生固氮菌的研究。由于生活在植株体内，几乎没有其它种类的微生物的干扰，内生固氮菌在植物体内通常能达到较高菌群密度，因此固氮效率远高于根际联合固氮。甘蔗是巴西的主要农作物，在巴西经济中占有重要地位，因此巴西有关甘蔗内生固氮菌的研究十分活跃。目前已有超过100种与甘蔗联合固氮的细菌被分离出来，它们的生理生化性状、固氮能力以及与甘蔗相互作用等方面都已做了系统的研究。甘蔗内生固氮菌GluconacetobacterdiatrophicusPAL5的全基因组DNA序列已于2009年发表，在此之前已有2种内生固氮菌的基因组序列被测定。由此可见国外对内生固氮菌研究的深度和广度。植物内生固氮菌除了能为宿主提供氮素以外，还同时具有分泌生长素、溶磷、增强植株抗病性、抗逆境等多方面的促进植物生长的作用。因此，联合(内生)固氮菌是一类非常有发展前景的农业微生物资源，充分发挥联合固氮菌的固氮促生长性能，对农业可持续发展具有重要意义。目前已发现联合固氮菌的宿主植物大多为具有重要价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等不能自主固氮的禾本科植物。针对长期单一施用化学肥料带来的土壤肥力下降，农产品品质下降和农业环境污染加剧等一系列对农业可持续发展的负面影响，积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种具有高固氮效率的哈夫尼菌YYBIO-001。本专利技术的哈夫尼菌YYBIO-001属于哈夫尼菌属(Hafniasp.)细菌，该菌株于2017年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.14502。本专利技术的哈夫尼菌YYBIO-001可用于固氮、产生固氮酶、促进植物生长以及制备相应的产品等。本专利技术的另一个目的是提供一种生物菌剂，该生物菌剂的活性成分为所述的哈夫尼菌YYBIO-001CGMCCNo.14502。该菌剂除包括含活性成分的哈夫尼菌YYBIO-001CGMCCNo.14502外，还可包括其他配合作用的菌株活性成分，和/或辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等，所述菌株活性成分可以为与哈夫尼菌具有配合作用的活性菌或活性菌的代谢产物。本专利技术的另一个专利技术目的在于提供哈夫尼菌YYBIO-001的制备方法，所述哈夫尼菌YYBIO-001由甘蔗茎部或根部组织分离获得，通过无氮培养基分离筛选，根据其功能确定为甘蔗内生固氮菌，对其固氮酶活性测定、16SrDNA序列分析，确定其为哈夫尼菌。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的哈夫尼菌YYBIO-001形成菌剂或生物肥料等类型产品，可应用于作物或植物的苗期促生、提高固氮效率、协助生长，同时减少化肥等产品应用频率。本专利技术的哈夫尼菌属(Hafniasp.)细菌菌株哈夫尼菌YYBIO-001，保藏号CGMCCNo.145028，能显著促进植物生长并且提高固氮作用，协助植物利用氮源。实验证明，利用本专利技术所述菌株接种甘蔗组培苗50d后植株干重和总氮含量分别比空白对照增加了53.12％和40.06％，固氮效率为13.76％；接种菌株YYBIO-001的玉米幼苗地上部分和根部干重比对照分别增加70.4％和121.4％，株高比对照增加26.7％，叶绿素含量增加了34.5％，氮含量增加了33.3％。本专利技术所述的Hafniasp.菌株具有联合固氮、分泌生长素等促植物生长的作用，可应用于生产具有促进植物育苗生长、提升固氮效率的固氮微生物菌剂和微生物肥料产品，对于减少化肥的使用、保护生态环境具有重要意义，并有广阔的应用前景。附图说明图1为本专利技术菌株所形成的菌落图；图2为本专利技术菌株的细胞形态图。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例和附图1-2对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。实施例1：本专利技术菌株哈夫尼菌YYBIO-001的分离取新鲜甘蔗蔗茎，挑选无虫洞节，将表皮在清水中洗净，于超净工作台上先以70％酒精擦试，将切茎用刀用无水酒精浸泡后在火焰上点燃，在蔗茎中间用刀环切约2mm深。用手将蔗茎折断，以无菌切刀选取无刀痕处，取0.5-1g甘蔗茎样品，以止血钳挤压出甘蔗茎组织液，取其进行10倍系列稀释，分别取原液和稀释液100μL，涂布于LPI无氮培养基(培养基成份：K2HPO40.2g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，NaMoO4·2H2O0.002g，FeCl3·6H2O0.01g，蔗糖100g，蒸馏水1000mL，琼脂15g)平板上，28℃培养3d，形成透明、凸起、表面光滑、边缘整齐菌落，菌株细胞呈杆状。所形成菌落及细胞性状具体见附图1及附图2。菌落长出后，在LPI无氮培养平板上用划线法进行菌种纯化，并通过镜检检查。纯化完成后制备成甘油管于超低温冰箱进行保存。实施例2：本专利技术菌株哈夫尼菌YYBIO-001的固氮酶活性采用乙炔还原乙烯法(acetylenereductionassay，ARA)测定固氮酶活性。将YYBIO-001活化后在LPI液体培养基中生长72h(3d)，取1mL菌液接种于灭菌的含10mLLPI液体培养基的60mL磨口小口瓶中，培养24h后从瓶内抽出5mL气体，然后再注入5mL乙炔气体，继续培养24h，用气相色谱仪检测乙烯生成量，以nmolC2H4/h·mL表示固氮酶活性。以模式菌株巴西甘蔗内生固氮菌G.diazotrophicusPAL5为阳性对照，以接种1mL灭活菌液的处理作为空白对照。实验结果表明，本专利技术菌株的固氮酶的乙炔还原乙烯活性约为2541nmolC2H4/h，而阳性对照巴西甘蔗内生固氮菌模式菌株G.diazotrophicusPAL5的固氮酶活性1675nmolC2H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种哈夫尼菌YYBIO‑001，其特征在于：所述哈夫尼菌YYBIO‑001的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14502。

【技术特征摘要】
1.一种哈夫尼菌YYBIO-001，其特征在于：所述哈夫尼菌YYBIO-001的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14502。2.如权利要求1所述的一种哈夫尼菌YYBIO-001的制备方法，其特征在于：所述哈夫尼菌YYBIO-001从甘蔗根部、茎杆或叶片分离、培养、挑选得到。3.如权利要求1所述的一种哈夫尼菌YYBIO-001的应用，其特征在于：所述哈夫尼菌YYBIO-001在促进植物生长上的应用。4.根据权利要求3所述的一种哈夫尼菌YYBIO-001的应用，其特征在于：所述哈夫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李庆红，袁欣荣，马一航，王艳艳，袁丹，伍惠，孙姣辉，赵凤，蒋洁，谭欢，刘梦佳，虞伟，
申请(专利权)人：湖南豫园生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43