本发明专利技术公开了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用，拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7，编号为CCTCC M 2018022。步骤是：A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于培养基，调节温度，振荡培养；B、每瓶装发酵液，按照比例加入单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，振荡培养；C、拮抗菌的分离：用浓度的酒精浸泡，再用无菌水漂洗，于培养箱中暗培养，将长出来的细菌菌落转移至新的培养基上划线分离纯化单菌落；D、分离纯化后，获得贝莱斯芽孢杆菌HNt7。该菌在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用。该菌株具有显著的防病效果，防效达到70.76%以上。经过贝莱斯芽孢杆菌HNt7喷施的梨树，显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。
【技术实现步骤摘要】
一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用
本专利技术属于植物病害生物防治
，更具体涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，同时还涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的用途。
技术介绍
梨树锈病由担子菌门胶锈菌属梨胶锈菌(GynmosporangiumharaeanumSyd.＝GynmosporangiumasiaticumMiyabeexYamada)引起，在中国梨园内发生较为普遍，可以导致叶片和果实脱落，严重影响产量。目前中国主要采用化学药剂进行防治，如代森锰锌、烯唑醇、三唑酮等，生物防治除了有报道采用梨胶锈菌重寄生菌(葡酒锈生座孢TuberculinavinosaSacc.)进行防治外，尚无商品化的生防制剂。长期施用化学农药可以导致农残超标，并易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物，破坏了生态平衡。从植物内筛选利用有益微生物，抑制病原菌的生长进行防病具有显著的经济和生态效益。目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、侧胞芽孢杆菌(B.laterosporus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等，但这些芽孢杆菌主要用于防治由曲霉、镰孢菌、链格孢、轮枝孢和腐霉菌引起的作物根部的病害如立枯病、猝倒病、枯萎病、根腐病、茎腐病、立枯病【KabalukT,GazdikK:DirectoryofMicrobialPesticidesforAgriculturalCropsinOECDCountries.AgricultureandAgri-Food.http://www4.agr.gc.ca/resources/prod/doc/pmc/pdf/micro_e.pdf2005,accessedNovember2014】，没有涉及梨树锈病的防治。贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)相关研究较少，前期报道该菌对棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、白菜黑斑病病菌(Alternariabrassicae)和番茄灰霉病灰菌(BotrytiscinereaPers)和兰花枯萎病菌(FusariumoxysporiumSchlecht.)具有拮抗作用【王伟,李术娜,李红亚,等.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析[J].中国农学通报,2009,25(19):14-19.杜淑涛,李术娜,朱宝成.白菜黑斑病拮抗细菌BacillusvelezensisDL-59的筛选鉴定及田间防效实验[J].河北农业大学学报,2010,33(6):51-56.王伟,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与X-75菌株鉴定[J].园艺学报,2010,37(2):307-312.索雅丽,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病菌颉颃菌株的筛选及功能基因的分析[J].中国植保导刊,2010,8:7-10.连彩,郭晓军,朱宝成,等.兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定[J].华北农学报,2012,27(2):222-225】，韩国学者发现该菌S3-5菌株对稻瘟病菌等有强拮抗作用【ChoegyeongjaK,JinC,etal.BacillusvelezensisS3-5strainandmethodforthebiological[P].RepublicofKorea,2008,10-1089149】，欧洲有研究者已将该菌AH2菌株申请专利作为作物病害的生物制剂[FernandezMAI,VillaverdeFMJ,CasanovaRJA,etal.ApurecultureofstrainAH2oftheBacillusvelezensisspeciesandaproductforthebiologicalcontrolofphytopathogenicfungi[P].Europe,2008,(PAT-EP2138044A1.]。目前，国内外尚无研究采用该菌进行梨树锈病的防治。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.1)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm。该菌株具有广谱抗真菌活性，如对果生核盘菌(Moniliniafructicola)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsistheae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriaberengeriana)、链格孢菌(Alternariaalternata)、胴枯病菌(Phomopsisfukushii)等均具有显著的抑菌活性，贝莱斯芽孢杆菌HNt7具有较强的活性以及耐储存特性，对梨锈病具有良好的防治效果、环境友好、抗菌谱广和防止梨树早期落叶的效果。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，方法易行，操作简便，制备的液体发酵液易溶于水，方便使用。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，该菌株的发酵液对梨锈病具有显著的防病效果，防效达到70.76％以上，优于较常用的化学杀菌剂甲基硫菌灵的防效(59.49％-63.7％)。此外，经过贝莱斯芽孢杆菌HNt7喷施的梨树，可以显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，其步骤是：A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mLLB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26－30℃、转速为150r/min，振荡培养22－26h。B、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150r/min振荡培养46－50h。C、拮抗菌的分离：在湖北省武汉市华中农业大学茶园采集健康的台茶四号茶叶，先用浓度为75％的酒精浸泡28－32s，再用无菌水漂洗2－4次，用无菌解剖刀将其切成长度约1cm的正方形小块，放于PDA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，PH值7.0左右)上，于25℃培养箱中暗培养2－4d左右，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。D、分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HNt7，菌株编号为HNt7，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HNt7，保藏编号为CCTCC M 2018022。
【技术特征摘要】
1.一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）HNt7，保藏编号为CCTCCM2018022。2.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQIDNO：1所示的16SrDNA核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQIDNO：2所示的gyrB核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQIDNO：3所示的rpoB核苷酸序列。5.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，其步骤是：A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mLLB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器中，调节温度为26－30℃、转速为150r/min，振荡培养22－26h；B、准备...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐文兴，赵梓茜，郭大勇，尤华锋，王利平，洪霓，王国平，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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