一种含有成纤维细胞生长因子10的胶原缓释水凝胶制造技术

本发明专利技术提供了人成纤维细胞生长因子10的胶原缓释水凝胶，其包括人FGF10和辅料，其中辅料包括胶原蛋白、泊洛沙姆407、甘油和海藻糖。

A collagen sustained-release hydrogel containing fibroblast growth factor 10

The present invention provides a collagen sustained-release hydrogel of human fibroblast growth factor 10, which includes human FGF10 and excipients, including collagen, poloxamer 407, glycerin and trehalose.

【技术实现步骤摘要】
一种含有成纤维细胞生长因子10的胶原缓释水凝胶
本专利技术属于蛋白质或多肽药物
，具体而言，本专利技术涉及成纤维细胞生长因子10的缓释水凝胶制剂。技术背景成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF10)是FGF家族的第10个成员，具有营养和保护神经元、促进损伤修复、诱导缺血区血管形成等功能，可显著加速急性损伤愈合。然而将FGF10应用于慢性炎性创面的修复时，效果并不理想(SandbornWJ1,SandsBE,WolfDCetal.Repifermin(keratinocytegrowthfactor-2)forthetreatmentofactiveulcerativecolitis:arandomized,double-blind,placebo-controlled,dose-escalationtrial.[J]AlimentPharmacolTher.2003,17(11):1355-64)。主要原因在于慢性创面存在炎症因子调控的细胞内环境，使成纤维细胞生长因子10很容易被细胞外蛋白酶降解而减弱其药理作用。因此，将FGF10应用在皮肤溃疡等慢性炎性创面，其效果受到极大影响。因此，如何有效地保护和缓慢释放生长因子成为临床上亟待解决的问题。与合适载体材料结合，可以使生长因子免受蛋白酶水解，并在创面局部缓慢有效释放。温敏型水凝胶是一种常温下为液体，温度升高可以自动凝结为胶状的高分子材料，其在水中溶胀可保持大量水分并具有三维网络状结构。水凝胶因其结构与体内细胞外基质相似而被广泛应用于组织工程和药物控制释放的研究。泊洛沙姆是一类具有反向温度敏感特性的高分子材料，其黏度随着温度的升高而升高。通过调整链段比例能够得到溶液-凝胶温度范围在20～85℃的亲水凝胶。但是，以泊洛沙姆为母体制备温敏材料时，高浓度的泊洛沙姆往往具有一定的细胞毒性，因此可以产业化的温敏凝胶需要降低泊洛沙姆的使用量，并具有较低的胶凝温度。本专利技术通过大量工作，筛选安全性能高的药用辅料泊洛沙姆为母体，利用胶原作为载药材料，以海藻糖作为稳定剂，从大量研究中专利技术了一种FGF10与胶原载体复合的泊洛沙姆温敏水凝胶制剂，可以有效减少泊洛沙姆的用量并且可使FGF10在三维空间环境中免受蛋白酶水解，在创面局部缓慢有效释放FGF10，对FGF10起到保护作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供可行的FGF10缓释水凝胶的制剂，其中包括FGF10蛋白，温敏凝胶基质泊洛沙姆407、药物载体材料胶原蛋白、蛋白保护剂甘油及海藻糖。优选在本专利技术的制剂中，FGF10蛋白和胶原蛋白、泊洛沙姆407、甘油、海藻糖的重量比为0.1-1.0：1.8-5.0：15-25：0.5-5.0：0.2-2.0，其余成分为水。另外也优选本专利技术的制剂还含有pH调节剂，优选含有10～20mM柠檬酸和柠檬酸钠。优选本专利技术的制剂的pH为5.0-6.6，优选为6.5。本专利技术具有以下有益效果：水凝胶具有在35℃以下呈液态，在35℃立即凝固成固态凝胶的性质。在25℃储存3个月，FGF10的活性和纯度几乎没有改变，对细胞无毒性。为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本专利技术范围的限制。依据本说明书的论述，本专利技术的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本专利技术引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本专利技术，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。附图说明图1显示了利用TUNEL细胞凋亡法检测FGF10/胶原/泊洛沙姆407对NIH3T3的细胞毒性研究。其中Control组为10％胎牛血清培养组；P407组为浓度为15％的泊洛沙姆407。No.3,No.4,No.6和No.8依次为3、4、6、8试验组。绿色荧光强代表细胞毒性大。具体实施方式1.实验仪器和材料1.1实验仪器pH计：上海精密科学仪器有限公司SNB-4型酸度计CO2培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司BB15电子分析天平：上海方瑞仪器有限公司FA2204多功能酶标仪：美国MDSpectraMaxM3渗透压仪：美国AdvancedFiske110电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司DRP-9052电泳仪、凝胶成像仪：Bio-Rad公司高效液相：Agilent1200立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂YXQ-LS-70A凝胶强度测试仪：英国SheenRef4141.2实验试剂FGF10及其标准品：浙江省生物技术制药工程重点实验室泊洛沙姆407：BASFSE胶原蛋白：江苏巨源公司胎牛血清：Sigma公司RPI-1640基础培养基：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司三抗：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司胰酶(含EDTA)：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司2实验方法2.1FGF10温敏凝胶配方的初步筛选我们选择了胶原蛋白，泊洛沙姆407，甘油和海藻糖4种成分，设计3水平，4因素L9(34)正交表(表1和表2)。然后根据正交表的配方，制备相应的温敏凝胶制剂，根据FGF10胶凝温度、体外释药性能，25℃稳定性和细胞毒性结果筛选出最优组合。表1辅料的不同浓度水平表23水平，4因素L9(34)正交表2.2配置过程称取处方量泊洛沙姆407加入到甘油中，充分浸润，加入适量20mM柠檬酸和柠檬酸钠(pH6.5)溶液室温过夜充分溶胀；加入处方量胶原蛋白和海藻糖，搅拌至完全溶解，加入处方量FGF10，补充处方量注射用水，即得[FGF10-胶原-泊洛沙姆]温敏型水凝胶。2.3[FGF10-胶原-泊洛沙姆]温敏凝胶的质量评价①胶凝温度的测定[FGF10-胶原-泊洛沙姆]溶液转入盐水瓶中加入磁力搅拌子，放入冰水浴中。盐水瓶的橡胶塞中间打孔并插入精度为0.1℃的精密温度计，温度计的水银球完全浸没在[FGF10-胶原-泊洛沙姆]溶液中。开启电磁搅拌，搅拌子的转速设定为500rpm，保持水浴持续缓慢升温，升温速率约每1-2min升高1℃。磁力搅拌子完全停止转动的温度即为胶凝温度，每一样品平行测定4次，结果取平均值，筛选出胶凝温度在35℃的[FGF10-胶原-泊洛沙姆]溶液浓度。②[FGF10-肝素-泊洛沙姆]递送系统的体外释放性能的考察选取胶凝温度符合条件的温敏凝胶，以0.9％NaCL为体外释放介质。采用Franz扩散池(TT-6透皮吸收仪)，接受池中注入新配0.9％NaCL，温度控制在体表温度,即(35±0.1)℃,转速500r/min。在每个供给池上方垂直滴入25～30μL药液后,计时开始。分别在给药后1～36小时，每小时取样一次。取样时沿侧管倾倒出全部5mL接收液,同时补以等体积(35±0.1)℃的0.9％NaCL。采用Lowry法检测FGF10含量,计算累积释放率,绘制累积释放率-时间曲线。③TUNEL分析检测[FGF10-胶原-泊洛沙姆]递送系统诱导的细胞凋亡选取胶凝温度符合条件的温敏凝胶，与NIH3T3细胞共培养24小时，用0.5％胰蛋白酶消化，将待检测成纤维细胞稀释至5×107/mL,于4％中性甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50～10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有成纤维细胞生长因子10的胶原缓释水凝胶，其包括人FGF10和辅料，其中辅料包括胶原蛋白、泊洛沙姆407、甘油和海藻糖。

【技术特征摘要】
1.一种含有成纤维细胞生长因子10的胶原缓释水凝胶，其包括人FGF10和辅料，其中辅料包括胶原蛋白、泊洛沙姆407、甘油和海藻糖。2.权利要求1所述的制剂，FGF10蛋白和胶原蛋白、泊洛沙姆407、甘油、海藻糖的重量比为0.1-1.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓杰，
申请(专利权)人：浙江唯美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33