一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途，首先将采用环氧氯丙烷活化法活化的琼脂糖凝胶作为载体，然后将基因重组蛋白G偶联到载体上，得到了蛋白G‑sepharose，再将失忆性贝类毒素抗体连接到蛋白G‑sepharose上，得到了抗体—蛋白G—sepharose，再用交联剂进行交联，得到了抗体—蛋白G—sepharose填料，最后将抗体—蛋白G—sepharose填料装柱后形成了高纯度和亲和力的失忆性贝类毒素免疫亲和柱，充分利用基因重组蛋白G与失忆性贝类毒素抗体特异性结合的特点，失忆性贝类毒素抗体的Fab片段暴露在外，大幅度提高了基因重组蛋白G的抗体结合能力、失忆性贝类毒素的捕捉能力和失忆性贝类毒素的纯化效率。

Amnesia shellfish poison immunoaffinity column and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of food safety detection technology, in particular to a kind of amnesia immunoaffinity column of shellfish toxin and its preparation method and use. First, the agarose gel activated by epichlorohydrin activation method is used as the carrier, and then the recombinant protein G is coupled to the carrier, and the protein G Sepharose is obtained, and then the loss of the protein is lost. The antibody of memristor is linked to the protein G Sepharose, and the antibody protein G - Sepharose is obtained. The crosslinking agent is used for crosslinking, and the antibody protein G Sepharose filler is obtained. Finally, the antibody protein G Sepharose filler is installed in the column to form an amnesic immunoaffinity column with high purity and affinity for the amnesia toxin. Taking full advantage of the specific binding of the recombinant protein G to the antibody of amnesia, the Fab fragment of the amnesic toxin antibody was exposed, which greatly improved the antibody binding ability of the recombinant protein G, the capture ability of the amnesia toxin and the purification efficiency of the amnesia beta toxin.

【技术实现步骤摘要】
一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途
：本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。
技术介绍
：亲和柱是将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在不溶性载体上，制成亲和吸附剂后所装的柱，多用做亲和层析。失忆性贝类毒素(Amnesicshellfishpoisoning，ASP)的主要成分是一种具有生理活性的氨基酸类物质-软骨藻酸(Domoicacid，DA)，是由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生的；DA是谷氨酸的一种异构体，是浮游植物代谢的产物，一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，红藻氨酸受体的兴奋剂，能够牢固结合谷氨酸受体，作用于兴奋性的氨基酸受体和突触传递素，提高钙离子的渗透性，使细胞长时间处于去极化的兴奋状态而导致死亡。当某些种类的硅藻大量发生时，双壳贝类、虾蟹类、头足类等较为低等的海洋动物，就能通过摄食藻类饵料而在体内积累大量的DA，低等的海洋动物一旦被海洋哺乳类动物摄食，就可能引起海洋哺乳类动物中毒或死亡。通过对该毒素的病理学研究发现，DA能与人类中枢神经系统(大脑海马)的谷氨酸受体结合，引起神经系统麻痹，并能导致大脑损伤；轻者引起神志不清和记忆丧失，重者引起死亡。在1987年发生爱德华王子岛贝类中毒事件之后，加拿大政府就制定了贝肉中DA的限量标准。随后，美国、欧洲、以及澳大利亚等纷纷采用欧盟标准，即20μgDAg-1贝肉；根据欧盟委员会指令(2002/226/EC)，一旦发现贝类样品中DA含量超标，则立刻关闭养殖场或捕捞水域。过去的研究认为双壳贝类在积累了大量DA的情况下往往没有任何不良症状，但随着研究的深入，发现赤潮毒素对双壳贝类有多种亚致死或致死性影响；例如，产麻痹性贝毒ParalyticShellfishToxins(PST)的塔玛亚历山大藻对双壳贝类孵化率、存活率、运动能力、滤食率和生长都有影响，同时还能抑制贝类闭壳运动、滤食率和清滤率；含有ASP的拟菱形藻P.multiserie会引起太平洋牡蛎Crassostreagigas呼吸性酸中毒和缺氧现象以及血液性质的变化；与此同时，毒藻赤潮还可能是造成养殖贝类大量死亡的主要原因。研究人员已经开发出了多种DA检测方法，包括小鼠生物检测、HPLLC-MS、荧光HPLC、GC-MS、TLC(薄层色谱)、氨基酸分析、CE(毛细管电泳)、CEC(Capillaryelectrochromatography)、ELISA、受体结合实验(Receptorbindingassay)等，其中荧光HPLC和受体结合实验的灵敏度(limitsofdetection，LOD)能达到0.001-0.002μgmL-1，而ELISA方法的检测下限(LOD)对贝肉样品是3.3μgkg-1，对海水样品是6.8ngL-1；小鼠生物检测是由Yasumoto等建立的,在小鼠腹腔注射酸性提取液，记录小鼠的死亡时间，使用“鼠单位”(Mu)来表达，美国公职分析化学家协会(AOAC)定义一个鼠单位为一只20g重的小白鼠在腹腔注射后15min内死亡的毒素最小剂量，小鼠生物检测由于时间较长，不能确定毒素的组成成分,定量困难,假阳性高(通常是由脂肪酸引起),重现性差，又不够灵敏(只适合检测40-100μgg-1以上浓度的DA)，已经不适用于20μgg-1的DA限量标准了。欧盟的官方DA检测方法是高效液相色谱(HPLC)法，液相色谱法的具体流程是试样经甲醇提取，强阴离子固相萃取柱净化，液相色谱分离，二极管阵列或紫外检测器进行定量分析；而ELISA法及其试剂盒(ASPDirectcELISAtestkits，BiosenseLaboratories，Norway)也因具有方便、快速、灵敏等特点，于2006年被国际分析化学家协会(AOAC)核准为官方检测方法。中国于2016年制定了贝类中失忆性贝类毒素的测定(GB5009.198—2016)，规定酶联免疫吸附法和高效液相色谱法测定贝类产品中ASP。中国专利201210554663.9公开的一种失忆性贝毒分子印迹整体柱的制备方法和应用，将适当配比的模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇)溶解于二甲基亚砜中，超声混合5分钟、静置20分钟，加入引发剂(偶氮二异丁腈)占单体总量的0.5-1％，充氮除氧5分钟，将此溶液充满石英毛细管，封端，60-70℃恒温聚合12-14小时，将毛细管连接到高效液相色谱输液泵上，清洗除去模板分子和致孔剂，最后得到具有良好分离效果的毛细管整体柱，所述分子印迹整体柱是以软骨藻酸为模板分子，甲基丙烯酰胺和/或甲基丙烯酸为功能单体，十二醇和/或1,4-丁二醇为致孔剂，二甲亚砜为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，哌嗪双丙烯酰胺为交联剂，超声溶解混匀，通氮除氧，灌注在经过γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修饰的25-250μm内径的石英毛细管中，封端；制备的印迹整体柱用于贝类样品中失忆类贝毒的萃取或富集，将制备的印迹整体柱连接到高效液相色谱中，并在液相色谱中实现失忆类贝毒的分离、富集与检测。对于失忆性贝类毒素的液相色谱检测来说，样品采集和前处理是目前分析方法中的瓶颈，也是测定误差的主要来源，样品前处理分为提取和净化2个步骤，实验中大多采用固相萃取柱对样品提取液中的失忆性贝类毒素进行净化，可以说样品的前处理技术是目前失忆性贝类毒素分析研究的难点和热点之一。蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，具有很高的亲和力，抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域，蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。因此，需要研发设计一种操作简单和净化效率高的失忆性贝类毒素免疫亲和柱，利用失忆性贝类毒素特异性抗体对待检样本中的失忆性贝类毒素进行分离和净化，很有社会和经济价值，应用前景广阔。
技术实现思路
：本专利技术的专利技术目的在于克服现有技术存在的缺点，设计一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途，使亲和柱的结构简单，亲和柱的制备方法操作简便，亲和柱使用时的净化效率高。为了实现上述目的，本专利技术涉及的失忆性贝类毒素免疫亲和柱的主体结构包括柱体、盖板、进样口、第一筛板、填料、第二筛板和出样口；圆管状结构的柱体的顶部设置有圆形片状结构的盖板，盖板的中心设置有圆管状结构的进样口，柱体的内部上部空间为空腔，柱体的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板，柱体的内部下部空间填充有填料，柱体的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板，第二筛板上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口；填料为腹泻性贝类毒素抗体-蛋白G-sepharose填料。本专利技术涉及的失忆性贝类毒素免疫亲和柱制备方法的具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：(一)活化：用蒸馏水充分冲洗浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose4B，洗去琼脂糖凝胶sepharose4B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose4B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱，其特征在于主体结构包括柱体、盖板、进样口、第一筛板、填料、第二筛板和出样口；圆管状结构的柱体的顶部设置有圆形片状结构的盖板，盖板的中心设置有圆管状结构的进样口，柱体的内部上部空间为空腔，柱体的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板，柱体的内部下部空间填充有填料，柱体的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板，第二筛板上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口；填料为腹泻性贝类毒素抗体‑蛋白G‑sepharose填料。

【技术特征摘要】
1.一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱，其特征在于主体结构包括柱体、盖板、进样口、第一筛板、填料、第二筛板和出样口；圆管状结构的柱体的顶部设置有圆形片状结构的盖板，盖板的中心设置有圆管状结构的进样口，柱体的内部上部空间为空腔，柱体的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板，柱体的内部下部空间填充有填料，柱体的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板，第二筛板上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口；填料为腹泻性贝类毒素抗体-蛋白G-sepharose填料。2.一种失忆性贝类毒素免疫亲和柱制备方法，其特征在于具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：(一)活化：用蒸馏水充分冲洗浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose4B，洗去琼脂糖凝胶sepharose4B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose4B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和5毫升浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液在温度为25℃的条件下下进行8小时的摇床反应，反应结束后，用50毫升蒸馏水洗涤湿凝胶，洗去湿凝胶中混杂的环氧氯丙烷，完成琼脂糖凝胶sepharose4B的活化，活化后的琼脂糖凝胶sepharose4B作为载体备用；(二)偶联：取1克载体用偶联缓冲液洗涤3次，将载体加入20毫升浓度为2mg/mL的基因重组蛋白G中在室温条件下偶联4小时，偶联缓冲液选取为pH值为8.9的摩尔质量为0.1M的NaHCO3水溶液和摩尔质量为0.8M的NaCl水溶液的混合液，将偶联后的载体用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，得到偶联有基因重组蛋白G的琼脂糖凝胶sepharose4B，简称为蛋白G-sepharose；(三)连接：将失忆性贝类毒素抗体溶解于pH值为7.4和浓度为20mM的PBS中，得到10毫升浓度为2mg/mL的抗体，将蛋白G-sepharose用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，PBS的每次使用量为30毫升，将抗体加入到洗涤过的蛋白G-sepharose中在室温条件下结合30分钟，得到连接有抗体的蛋白G-sepharose，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤连接有抗体的蛋白G-sepharose3次，PBS的每次使用量为30毫升，连接有抗体的蛋白G-sepharose简称为抗体—蛋白G—sepharose；(四)交联：用pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液洗涤抗体—蛋白G—sepharose3次，硼酸缓冲液的每次使用量为30毫升，在抗体—蛋白G—sepharose中加入pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液以及交联剂，交联剂为庚二亚氨酸二甲酯，当抗体—蛋白G—sepharose的浓度为20mM时停止交联剂的加入，使抗体—蛋白G—sepharose、硼酸缓冲液和交联剂在室温条件下交联1小时，加入pH值为9.0和浓度为50mM的乙醇胺终止交联，并用浓度为50mM的乙醇胺封闭10分钟，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤交联后...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳家鹏，王涛，于蓉，龚利新，
申请(专利权)人：山东美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37