本发明专利技术公开了一种呕吐毒素半抗原，该半抗原的分子结构如下所示：，本发明专利技术还公开了该半抗原、人工抗原和以此人工抗原制备抗体的方法，以及半抗原、抗体的用途。本发明专利技术制备的抗体特异性好、灵敏度高，与结构类似物交叉反应低。因此，本发明专利技术的抗原和制备的抗体可用于建立免疫学检测方法，从而用于快速检测食品中的呕吐毒素。品中的呕吐毒素。品中的呕吐毒素。
【技术实现步骤摘要】
一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用
[0001]本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
技术介绍
[0002]呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) ，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）。由于它们具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm。
[0003]目前对的检测方法多为仪器检测，如薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱
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质谱法、气相色谱
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质谱法等。仪器检测法虽然具有较高的准确性，但是样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重，从而限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附测定技术Enzyme
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Linked Immunosorbent Assay(ELISA)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，可以进行现场操作。适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是高特异性、高亲和力的抗体的制备，而呕吐毒素作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。
技术实现思路
[0004]为了解决以上现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种呕吐毒素半抗原，该半抗原的分子结构如下所示：
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[0006]进一步的，本专利技术所述呕吐毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）取5mL单口瓶，称取呕吐毒素标准品10mg、ZnCl
2 2mg、γ
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氨基丁酸5mg，加入二氯甲烷2mL，室温搅拌反应过夜；（2）TLC检测反应完全后，加入5mL水，用5mL二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到呕吐毒素半抗原。
[0007]一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后制备而得。
[0008]进一步的，本专利技术所述呕吐毒素人工抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）取4mg权利要求1所述的半抗原、3.5 mg NHS、5 mg EDC溶于200μL DMF溶液中，反应2h；（2）将20 mg载体蛋白溶于2mL的pH9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得呕吐毒素人工抗原。
[0009]进一步的，本专利技术所述呕吐毒素人工抗原的制备方法，所述载体蛋白为BSA、OVA或KLH。
[0010]一种采用本专利技术所述的呕吐毒素人工抗原免疫小鼠制得的能与呕吐毒素发生特异性免疫反应的呕吐毒素抗体。
[0011]一种本专利技术所述的呕吐毒素抗体在检测食品中呕吐毒素残留量的应用。
[0012]有益效果：本专利技术提供了一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用，使用该方法合成的半抗原制备的人工抗原，免疫小鼠后得到的单克隆抗体的检测限为1ng/mL。本专利技术制备的抗体特异性好、灵敏度高，与结构类似物交叉反应低。因此，本专利技术的抗原和制备的抗体可用于建立免疫学检测方法，从而用于快速检测食品中的呕吐毒素。
附图说明
[0013]图1 为呕吐毒素半抗原的合成路线图。
具体实施方式
[0014]下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。
[0015]实施例1 半抗原的合成与鉴定所述呕吐毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）取5mL单口瓶，称取呕吐毒素标准品10mg、ZnCl
2 2mg、γ
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氨基丁酸5mg，加入二氯甲烷2mL，室温搅拌反应过夜；
（2）TLC检测反应完全后，加入5mL水，用5mL二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到呕吐毒素半抗原。
[0016]合成路线如下所示：。
[0017]核磁共振鉴定结果：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.62 (dq, J=5.9, 1.4Hz, 1H), 5.31 (dt, J=11.2, 4.4Hz, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.78 (s, 2H), 4.74 (d, J=5.9Hz, 1H), 3.99 (d, J=4.5Hz, 1H), 3.86 (d, J=11.5Hz, 1H), 3.77 (br, 1H), 3.76 (d, J=11.5Hz, 1H), 3.22 (d, J=4.1Hz, 1H), 3.14 (d, J=4.1Hz, 1H), 2.80 (dd, J=15.7, 4.3Hz, 1H), 2.5(m, 2H), 2.25 (m, 3H), 1.91 (br, 3H), 1.78 (m, 2H), 1.71 (br, 1H), 1.17 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 201.3, 182.5, 140.0, 136.9, 88.8, 86.0, 78.8, 71.0, 67.0 , 62.1, 50.4, 50.2, 49.9, 47.5, 42.3, 35.9, 25.9, 18.0, 16.5. HRMS (ESI) Calcd for C19H30NO8+ (M+H)+ 400.1966, found: 400.1983.实施例2 人工抗原的合成1、免疫原的合成（1）取4mg权利要求1所述的半抗原、3.5 mg NHS、5 mg EDC溶于200μL DMF溶液中，反应2h；（2）将20 mg BSA溶于2mL的pH9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种呕吐毒素半抗原，其特征在于，该半抗原的分子结构如下所示：。2.权利要求1所述呕吐毒素半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取5mL单口瓶，称取呕吐毒素标准品10mg、ZnCl
2 2mg、γ
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氨基丁酸5mg，加入二氯甲烷2mL，室温搅拌反应过夜；（2）TLC检测反应完全后，加入5mL水，用5mL二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到呕吐毒素半抗原。3.一种呕吐毒素人工抗原，其特征在于，所述人工抗原由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后制备而得。4.权利要求1所述呕吐毒素人工抗原的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：周皓，张勋，柳家鹏，
申请(专利权)人：山东美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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