一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法，属于蛋白质检测技术领域。本发明专利技术所述结合缓冲液作为乳铁蛋白的提取液，能够保证亲和柱对乳品中乳铁蛋白的结合能力，可实现对样本中乳铁蛋白的富集和检测，提高了产品中乳铁蛋白的提取率和回收率，克服样本基质对目标物质的影响，能够适用不同类型乳品中乳铁蛋白的提取，可满足不同类型乳品中乳铁蛋白的定量检测，且回收率均能达到90％以上，结果稳定，且洗脱后峰形好，杂质峰少。杂质峰少。杂质峰少。

【技术实现步骤摘要】
一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质检测
，尤其涉及一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法。

技术介绍

[0002]乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是乳汁中一种重要的铁结合糖蛋白，相对分子质量为70～80kDa，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛分布于哺乳动物乳汁中，特别是初乳中，在其他多种组织分泌液(唾液、泪液或胆汁等)中也含有乳铁蛋白，为大量病原微生物入侵的粘膜系统提供了第一道最重要的防线。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌和调节免疫系统等强大生物功能，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。
[0003]乳铁蛋白具有七大作用：调节机体的免疫反应、调节胃肠道铁的吸收、广谱抗菌作用、抗病毒、抗氧化、抗癌以及同药物的协同作用。正因为乳铁蛋白所具有的这七大功效，许多科学家和医学家开始把它应用到临床，在预防和治疗疾病过程中进行了探索，并取得临床医学专家的认可。
[0004]随着人民生活水平的不断提高，国内乳品朝着更高品质的方向发展，对于乳品的评价指标包括碱性磷酸酶、过氧化物酶、乳铁蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳果糖和糠氨酸。其中乳铁蛋白是非常关键的指标之一，因此建立一种能够准确快速检测样本中乳铁蛋白含量的方法特别重要。目前，乳品中乳铁蛋白的检测方法主要有：免疫学方法(免疫胶体金法、酶联免疫法)、高效毛细管电泳法、原子吸收分光光度法、凝胶成像系统SDSr/>‑
PAGE法和高效亲和色谱法。
[0005]其中，免疫胶体金法具有方便快捷、成本低等优势，但是对于乳品中乳铁蛋白的含量无法准确定量。免疫胶体金法对于乳品中的乳铁蛋白具有高灵敏度的特点，而操作过程较为繁琐，结果偏差难以控制。高效毛细管电泳法具有高效、高灵敏度和自动化程度高等特点，但是进样量少、分离重现性差，对于乳品中高乳铁蛋白含量的检测稍显不便。原子吸收分光光度法常用于检测金属元素和部分非金属元素，在乳品中蛋白的检测领域应用较少。此外，凝胶成像系统SDS
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PAGE对于乳铁蛋白的检测灵敏度不如酶联免疫法，准确度不如高效液相色谱法，而且操作过程复杂，耗时较长。
[0006]高效亲和色谱则利用某些相对专一分子的可逆结合来实现分离的目的，例如抗原和抗体、酶和底物等。两种特异性结合的分子互为配基，将与待测样品特异性结合的配基固定在水不溶性载体上制成亲和柱，通过目标物质与亲和柱的特异性结合来达到目标物质的分离纯化目的，并结合高效液相色谱检测。采用这种方法更加准确、操作简单，能够满足绝大多数样品的提纯、检测和分析。其中，亲和柱对于样品中目标物质的结合能力起着决定性的作用，而这与样品的前处理过程密不可分。目前，采用现有团体标准《T/TDSTIA006
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2019》的方法，对乳品中的乳铁蛋白的回收率较低，对于乳铁蛋白的定值结果不准确。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液及其制备方法和应用、牛乳铁蛋白的检测方法，所述结合缓冲液对乳铁蛋白具有优异的回收效果。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，包括以下制备原料：十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水；所述十二水合磷酸氢二钠在结合缓冲液中的浓度为30.083g/L；所述二水合磷酸二氢钠在结合缓冲液中的浓度为2.496g/L；所述提取试剂在结合缓冲液中的体积浓度为20％；所述提取试剂为氯化钠和吐温
‑
20的混合水溶液。
[0010]优选的，所述氯化钠在提取试剂中的质量浓度为146.1g/L；所述吐温
‑
20在提取试剂中的体积浓度为25％。
[0011]本专利技术提供了上述技术方案所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
[0012]按照所述制备原料的浓度配比，将十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和提取试剂混合溶解于水，得到乳铁蛋白提取用结合缓冲液；所述提取试剂为氯化钠和吐温
‑
20的混合水溶液。
[0013]本专利技术提供了上述技术方案所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或上述技术方案所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液在检测乳铁蛋白中的应用。
[0014]本专利技术提供了一种牛乳铁蛋白的检测方法，包括以下步骤：
[0015]将含有牛乳铁蛋白的样品与结合缓冲液混合，进行提取，得到提取液；所述结合缓冲液为上述技术方案所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或上述技术方案所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液；
[0016]采用肝素亲和柱，将所述提取液进行净化，得到含有纯化乳铁蛋白的净化液；
[0017]将所述含有纯化乳铁蛋白的净化液进行高效液相色谱检测，得到乳铁蛋白含量。
[0018]优选的，所述含有牛乳铁蛋白的样品与结合缓冲液的用量比为(1～20)g:50mL。
[0019]优选的，所述提取的次数为1～2次；每次提取的温度为4℃，时间为10min。
[0020]优选的，所述高效液相色谱检测的条件包括：梯度洗脱程序：0～5min，流动相A70％，流动相B30％；5.0～10min，流动相A45％，流动相B55％；10.00～12min，流动相A40％，流动相B60％；12.00～16min，流动相A70％，流动相B30％；所述流动相A为质量浓度0.1％的TFA；所述流动相B为乙腈。
[0021]优选的，所述高效液相色谱检测的条件还包括：检测波长：紫外280nm；柱温：30℃；进样体积：30μL；流速：1mL/min。
[0022]优选的，所述乳铁蛋白含量＝(高效液相色谱检测的上机检测浓度
×
4(肝素亲和柱的洗脱体积)
×
肝素亲和柱的定容体积)/(肝素亲和柱的上样体积
×
称样量
×
1000)mg/g；所述上机检测浓度的单位为μg/mL；所述洗脱体积、定容体积和上样体积的单位均为mL；所述称样量的单位为g。
[0023]本专利技术提供了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，包括以下制备原料：十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水；所述十二水合磷酸氢二钠在结合缓冲液中的浓度为30.083g/L；所述二水合磷酸二氢钠在结合缓冲液中的浓度为2.496g/L；所述提取试剂在结合缓冲液中的体积浓度为20％；所述提取试剂为氯化钠和吐温
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20的混合水溶液。本
专利技术所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液中，提取试剂为氯化钠和吐温
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20，钠离子与奶制品中钙离子在乳铁蛋白与肝素结合中存在协同效应，可以提高乳铁蛋白与肝素的结合能力。吐温20作为表面活性剂，能够降低肝素亲和柱的非特异性吸附，增强肝素和乳铁蛋白的特异性结合，同时对乳铁蛋白具有保护作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，其特征在于，包括以下制备原料：十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水；所述十二水合磷酸氢二钠在结合缓冲液中的浓度为30.083g/L；所述二水合磷酸二氢钠在结合缓冲液中的浓度为2.496g/L；所述提取试剂在结合缓冲液中的体积浓度为20％；所述提取试剂为氯化钠和吐温
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20的混合水溶液。2.根据权利要求1所述的乳铁蛋白提取用结合缓冲液，其特征在于，所述氯化钠在提取试剂中的质量浓度为146.1g/L；所述吐温
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20在提取试剂中的体积浓度为25％。3.权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按照所述制备原料的浓度配比，将十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠和提取试剂混合溶解于水，得到乳铁蛋白提取用结合缓冲液；所述提取试剂为氯化钠和吐温
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20的混合水溶液。4.权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或权利要求3所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液在检测乳铁蛋白中的应用。5.一种牛乳铁蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有牛乳铁蛋白的样品与结合缓冲液混合，进行提取，得到提取液；所述结合缓冲液为权利要求1或2所述乳铁蛋白提取用结合缓冲液或权利要求3所述制备方法制备得到的乳铁蛋白提取用结合缓冲液；采用肝素亲和柱，将所述提取液进行净化，得到含有纯化乳铁蛋白的净化液；将所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：田秀梅，武冬霞，顾浩，柳家鹏，
申请(专利权)人：山东美正生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：