动物组织中颠茄类生物碱的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，采用分散固相萃取

【技术实现步骤摘要】
动物组织中颠茄类生物碱的检测方法


[0001]本专利技术涉及检测
，具体涉及一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法。

技术介绍

[0002]曼陀罗、天仙子、颠茄等有毒茄科植物中含有多种有毒生物碱，如莨菪碱、阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱等。这些生物碱统称为颠茄生物碱(belladonna alkaloids)，也称莨菪烷生物碱(tropane alkaloids)。颠茄生物碱能干扰大脑皮层，产生中枢抑制，能竞争性阻断M胆碱受体对呼吸中枢具有的兴奋作用，会引起口干、瞳孔扩散、声音嘶哑、心跳加速、血管扩张、间歇抽搐或痉挛等现象，导致中枢系统产生紊乱，狂躁、眩晕、幻觉、一般剂量可使人感觉疲倦，进入无梦之睡眠，服用者如果过量使用，会产生精神错乱、意识恍惚，并伴有幻觉，昏迷等症状，最终出现呼吸衰竭而死亡。山莨菪碱和阿托品能使延髓和大脑兴奋，服用者表现得十分狂躁，并伴有胡言乱语的症状，也会出现抑制症状，使服用者出现昏迷，抑制其呼吸，严重者则会死亡。近年来被发现除临床治疗用外的一些特殊效用：如改善肉类品质(类“瘦肉精”)协同注水等。此类药物及其代谢物不可避免地会残留于猪体内，而该类药物残留通过食物链进入人体达到一定浓度会出现恶心、呕吐、头晕、无力、四肢及口舌麻木等症状,严重者出现呼吸衰竭而死亡。
[0003]综上，建立高效可靠的上述药物检测方法，对于发现颠茄类生物碱原药与代谢物的潜在风险以及开展有关研究具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，以解决现有技术中存在的不足。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提出一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，包括：
[0006]样品制备，解冻后的待测动物组织清洗后，切块、捣碎，分装样品容器中，保存备用；
[0007]样品提取，称取样品5g试样，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入50μL内标工作液涡旋混匀30s，并静止10min，加入15mL酸化乙腈旋涡混匀1min后，旋涡混匀1min后， 35℃～55℃超声提取10min，取出冷却至室温，4500r/min离心5min，上清液转移至100mL 鸡心瓶中；
[0008]将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，得到第二次的上清液，将两次的上清液合并，45℃，旋转蒸发至近干，得到残渣；
[0009]样品净化，向所述残渣内加入50μL甲醇，水，溶解残渣，转移至2mL离心管中，用水定容至1.0mL，加入吸附剂，涡旋振荡30S，加入1mL正己烷，涡旋振荡10S，12000r/min 离心5min，弃去上层油脂层，重复净化一次，至
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20℃冷冻30min，12000r/min离心5min，下层清液经过滤后供液质使用；
[0010]样品检测，将所述过滤后的下层清液上机检测，检测条件包括：
[0011]色谱柱：InfinityLabPoroshell120HPH
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C18(2.1mm
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100mm，1.9μm)；流速：0.2 mL/min；流动相：A相为5mM甲酸铵+0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量：10μL；内外标法定量；
[0012]质谱离子源:ESI；离子源温度:100℃；干燥气流量:10L/h；毛细管电压:4000V；气流温度:350℃；雾化气压力:40psi；碰撞气类型:氮气；扫描方式:正离子；检测方式:MRM。
[0013]根据本专利技术的一个实施例，所述吸附剂包括10mgPSA,10mg NH2、20mg中性氧化铝。
[0014]根据本专利技术的一个实施例，所述梯度洗脱条件以体积分数计，流速为0.2ml/min；在0～ 1min，流动相A相为95％，流动相B相为5％；在2～4min，流动相A相为90％，流动相B相为10％；在5min，流动相A相为50％，流动相B相为50％；在10min，流动相A相为20％，流动相B相为50％；在10～15min，流动相A相为95％，流动相B相为5％。
[0015]根据本专利技术的一个实施例，将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，包括：震散固体，加入15mL酸化乙腈，手摇上下震荡30s后，旋涡混匀加超声，得到第二次的上清液。
[0016]根据本专利技术的一个实施例，所述下层清液过滤，包括：将所述下层清液经0.22μm滤膜过滤。
[0017]根据本专利技术的一个实施例，所述动物组织包括：动物肌肉、肉、心、肝、肾、肺中的一种或多种。
[0018]根据本专利技术的一个实施例，检测方法还包括：
[0019]标准储备液：分别称量适量山莨菪碱、消旋山莨菪碱、氢溴酸樟柳碱、硫酸阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、氢溴酸后马托品、托品酸、去甲阿托品经折算后的山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品含量均为 10mg，用甲醇定容至10mL棕色容量瓶中，制备为质量浓度为1000μg/mL标准储备液；
[0020]移取山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品标准溶液，用甲醇定容于10mL棕色容量瓶中,制备为质量浓度为 1000ng/mL混合中间液；
[0021]在空白基质中分别加入10ng/mL混合标准溶液20μL、50μL、100μL、0.5mL、2mL，加入1000ng/mL混合标准溶液50μL、100μL、200μL，按照与样品相同提取与净化步骤进行处理，制备8个质量浓度标准溶液为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、20 ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL，后马托品为内标，内标法绘制工作曲线。
[0022]本专利技术实施例的检测方法至少具有以下有益效果：
[0023]根据本专利技术实施例的动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，能够精准的测出动物组织中的颠茄类生物碱，测定结果准确可靠，为颠茄类生物碱的测量提供了可靠的数据，具有显著的经济效益，具有广阔的市场前景。对于指导药物残留的测量具有很好的参考价值。
附图说明
[0024]图1是本专利技术的猪肉基质中山莨菪碱特征离子质量相关谱图；
[0025]图2是本专利技术的猪肉基质中消旋山莨菪碱特征离子质量相关谱图；
[0026]图3是本专利技术的猪肉基质中樟柳碱特征离子质量相关谱图；
[0027]图4是本专利技术的猪肉基质中去甲阿托品特征离子质量相关谱图；
[0028]图5是本专利技术的猪肉基质中阿托品特征离子质量相关谱图；
[0029]图6是本专利技术的猪肉基质中后马托品特征离子质量相关谱图；
[0030]图7是本专利技术的猪肉基质中莨菪碱特征离子质量相关谱图；
[0031]图8是本专利技术的猪肉基质中东莨菪碱特征离子质量相关谱图；
[0032]图9是本专利技术的猪肉基质中SKF
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525A特征离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，其特征在于，包括：样品制备，解冻后的待测动物组织清洗后，切块、捣碎，分装样品容器中，保存备用；样品提取，称取样品5g试样，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入50μL内标工作液涡旋混匀30s，并静止10min，加入15mL酸化乙腈旋涡混匀1min后，旋涡混匀1min后，35℃～55℃超声提取10min，取出冷却至室温，4500r/min离心5min，上清液转移至100mL鸡心瓶中；将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，得到第二次的上清液，将两次的上清液合并，45℃，旋转蒸发至近干，得到残渣；样品净化，向所述残渣内加入50μL甲醇，水，溶解残渣，转移至2mL离心管中，用水定容至1.0mL，加入吸附剂，涡旋振荡30S，加入1mL正己烷，涡旋振荡10S，12000r/min离心5min，弃去上层油脂层，重复净化一次，至
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20℃冷冻30min，12000r/min离心5min，下层清液经过滤后供液质使用；样品检测，将所述过滤后的下层清液上机检测，检测条件包括：色谱柱：InfinityLabPoroshell120HPH
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C18(2.1mm
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100mm，1.9μm)；流速：0.2mL/min；流动相：A相为5mM甲酸铵+0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量：10μL；内外标法定量；质谱离子源:ESI；离子源温度:100℃；干燥气流量:10L/h；毛细管电压:4000V；气流温度:350℃；雾化气压力:40psi；碰撞气类型:氮气；扫描方式:正离子；检测方式:MRM。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述吸附剂包括10mgPSA,10mg NH2、20mg中性氧化铝。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件以体积分数计，流速为0.2ml/min；在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠峰，魏春雁，范宏，刘笑笑，孟繁磊，宋志峰，张慧，郑妍婕，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：