热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术技术领域，尤其涉及热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。本发明专利技术提供了热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测标志物的应用，经实验证实，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，对幽门螺杆菌毒力型的检出率大幅提高，准确率可达98％以上，且该标志物其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性。

Application of heat shock protein groEL in preparing reagents for detection of Helicobacter pylori

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the application of heat shock protein groEL in preparing reagents for detection of Helicobacter pylori. The invention provides the application of heat shock protein groEL as a detection marker for Helicobacter pylori. It has been proved by experiments that the detection rate of HP groEL as a marker for Helicobacter pylori detection has been greatly improved, the accuracy rate can reach more than 98%, and the marker is not affected by the non toxic Helicobacter pylori. The interference of bacilli or other pathogenic bacteria has good specificity.

【技术实现步骤摘要】
热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用
本专利技术涉及生物技术
，尤其涉及热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。
技术介绍
热休克蛋白是一种从细菌到哺乳动物中广泛存在的应激蛋白质。已有研究报导，幽门螺杆菌的热休克蛋白可能充当了胃粘膜慢性病发展和持续的启动因子。幽门螺杆菌抗体分型是目前常用的分型方法，其对于幽门螺杆菌的毒力评价和指导临床治疗的价值得到了广泛认可，可以更加科学有效地服务于幽门螺杆菌相关疾病的精准治疗。现有的幽门螺杆菌分型方法主要是以CagA(细胞毒素)或VacA(空泡毒素)抗体存在与否判断所感染幽门螺杆菌的毒力水平，高毒力菌株往往同时表达这两种毒力蛋白，而低毒力(或者无毒力)菌株往往不表达上述毒力蛋白。但临床也发现非毒力型幽门螺杆菌感染者中也有不少发展成为幽门螺杆菌相关疾病，显示单单只以CagA或VacA作为Hp毒力型的指标是不完整的。因此，进一步开发精准的幽门螺杆菌检测标志物是十分必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用，其能够降低毒力型幽门螺杆菌感染的漏检率。本专利技术提供了热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。本专利技术中，所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQIDNO:l所示。本专利技术所述检测为幽门螺杆菌的分型检测。本专利技术试验表明，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，能够实现对幽门螺杆菌毒力型的准确检测，其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性，且能够降低毒力型幽门螺杆菌的漏检率。本专利技术还提供了一种幽门螺杆菌检测试剂盒，其包含热休克蛋白groEL的检测试剂。本专利技术所述检测试剂为包被有热休克蛋白groEL的酶标板；所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQIDNO:l所示。本专利技术中，包被有热休克蛋白groEL的酶标板的制备方法包括：以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，以SEQIDNO:2～3所示序列的引物进行扩增，获得groEL基因片段；将所述groEL基因片段链接入载体pTrchis2C后，获得重组质粒；所述重组质粒经扩增后转化入大肠杆菌Rosetta，经诱导表达、纯化，获得重组groEL蛋白；将所述重组groEL蛋白与包被液混合后包被至酶标板，然后经洗涤、封闭、干燥制得包被有热休克蛋白groEL的酶标板。所述载体pTrchis2C的链接位点为XhoI和KpnI。所述包被蛋白的浓度为1μg/ml，包被的量为100μl/well。所述包被的条件为4℃包被过夜或37℃包被2h。本专利技术提供的试剂盒中，还包括Elisa检测试剂。本专利技术还提供了一种非诊断目的的幽门螺杆菌的分型检测方法，为将待测样品稀释后，与包被有热休克蛋白groEL的酶标板共同孵育，经洗涤、与二抗孵育后，进行显色，根据显色结果判断是否感染毒力型幽门螺杆菌。所述判断为，以阴性血清的OD值的2.1倍为cutoff值，高于cutoff则为感染毒力型幽门螺杆菌，低于cutoff则未感染毒力型幽门螺杆菌。检测方法中，所述与包被有热休克蛋白groEL的酶标板共同孵育的温度为室温，时间为30min。所述室温优选18℃～30℃。所述待测样品为血浆、组织重悬液或样品清洗液。所述与二抗孵育的温度为室温，时间为30min。所述室温优选18℃～30℃。所述二抗为兔抗人抗体。所述显色的显色剂为TMB。本专利技术提供了热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测标志物的应用，经实验证实，以热休克蛋白groEL作为幽门螺杆菌检测的标志物，对幽门螺杆菌毒力型的检出率大幅提高，准确率可达98％以上，且该标志物其不受非毒力型幽门螺杆菌或其他病原菌的干扰，具有良好的特异性。附图说明图1示groEL目的基因扩增出单一条带；图2示质粒双酶切验证；图3示蛋白诱导表达结果；图4示蛋白纯化结果。具体实施方式本专利技术提供了热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1重组groEL蛋白的制备一、groEL目的基因的获取：1.groEL引物的设计：groEL-F:cgcgctcgagggcaaaagaaatcaaatgroEL-R:tctggtacccatcatgccacccatggc2.以菌株NCTC11637为模板扩增groEL目的基因：PCR反应体系如下：PCR反应参数：PCR电泳产物图如图1。结果分析：groEL目的基因扩增出单一条带，大小在1500bp～2000bp之间，符合目的基因groEL1638bp的大小。二、目的基因groEL与载体pTrchis2C的双酶切、连接和转化1.目的基因groEL与载体pTrchis2C的双酶切用XhoI和KpnI双酶切质粒载体pTrchis2C和目的基因groEL，反应体系如下：2.目的基因groEL与载体pTrchis2C的连接体系如表1：表1目的基因groEL与载体pTrchis2C的连接体系22℃连接10min。3.将groEL/pTrchis2C和pTrchis2C自连分别转化DH5α感受态。三、重组质粒的挑选验证：1.在groEL/pTrchis2CDH5α挑选单菌落，摇菌，抽质粒，双酶切验证(图2)结果分析：groEL/pTrchis2C经XhoI和KpnI双酶切后，产生线性载体和插入基因，插入基因大小在1500bp～2000bp之间，符合插入片段大小。四、目的蛋白的诱导表达、纯化1.将groEL/pTrchis2C转化表达菌Rosetta感受态细胞2.诱导表达：挑取单个groEL/pTrchis2CRosetta菌落摇菌，待OD600＝0.5时，加入100mMIPTG,使其终浓度为1mM，诱导表达，电泳检测(图3)：结果分析：groEL/pTrchis2CRosetta经诱导，在65kDa左右出现明显的诱导条带。3.纯化：经超声破碎后，用Ni-NTA对超声上清纯化，纯化结果如图4。结果分析：groEL蛋白的纯化效果不错，是所需要的目的条带。实施例2酶标板的制备1、稀释重组groEL蛋白至1μg/ml作为包被液，100μL/well，放入铝箔袋中4℃过夜包被(37℃包被2h效果一样)。2、甩去包被液，拍干。3、用洗涤液洗涤三次，每次浸泡1min，300μL/well，甩去洗涤液，拍干。4、封闭：封闭液200μl/well，37℃封闭1h，甩去封闭液，拍干，洗涤三次方法同上。5、37℃烘干1～2h。6、将烘干的酶标板和干燥剂放入铝箔袋4℃封存备用。实施例3ELISA检测幽门螺杆菌1、待测样品：样品1：将确认不含groEL抗体的阴性血清分别用样本稀释液稀释100倍，并在稀释的阴性血清里分别加入大肠杆菌、变性杆菌、空肠弯曲菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、白色假本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.热休克蛋白groEL在制备幽门螺杆菌检测的试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQIDNO:l所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测为幽门螺杆菌的分型检测。4.一种幽门螺杆菌检测试剂盒，其特征在于，包含热休克蛋白groEL的检测试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为包被有热休克蛋白groEL的酶标板；所述热休克蛋白groEL的氨基酸序列如SEQIDNO:l所示。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有热休克蛋白groEL的酶标板的制备方法包括：以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，以SEQIDNO:2～3所示序列的引物进行扩增，获得groEL基因片段；将所述groEL基因片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘谦，王洪涛，马伟民，张永顶，
申请(专利权)人：深圳市伯劳特生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44