基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法技术

本发明专利技术公开了基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，具体步骤如下：样品蛋白提取；采用Brad ford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明专利技术能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现肝癌肝郁证中的特异性蛋白标记物，为肝癌肝郁证早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

Salivary proteomics based biomarker detection method for hepatocellular carcinoma with liver depression

The present invention discloses a method for detection of liver depression biomarkers based on saliva proteomics. The specific steps are as follows: sample protein extraction; Determination of protein concentration by Brad Ford; proteolysis; iTRAQ labeling; vacuum freezing centrifugal drying; reversed phase chromatographic separation under high pH conditions; ABI 5600 Protein analysis and mass spectrometry data analysis: in the selection of database, if the database was selected for sequencing, the database of the species was selected directly. If it was not sequenced, the database of the large class protein group was the most related to the sample, and the mass spectrometric analysis of iTRAQ was carried out by ABI 5600 mass spectrometer. The invention can detect the specific protein markers in liver depression syndrome of liver cancer quickly and reliably, and establish a non-invasive, simple, quick and practical detection and evaluation method for the early diagnosis and treatment of liver depression syndrome of liver cancer, recurrence, metastasis and prognosis of liver cancer.

【技术实现步骤摘要】
基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法
本专利技术涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法。
技术介绍
随着人类基因组计划(humangenomicproject，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究。蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在；与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作用，而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白质和多肽有2300多种，主要有α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、黏蛋白等蛋白质，其中有98％的唾液蛋白质是富酪蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有28.7％(比例最大)，与免疫功能相关的蛋白质占21％，与蛋白质复制及修复相关的蛋白质占1.6％，与细胞动力及分泌相关的蛋白质占4.8％，与转录和核糖体相关的蛋白质占2.3％，与细胞繁殖及细胞循环相关的占4.2％，而与信号传导、代谢、细胞骨架及内膜相关的蛋白质分别占9.7％、5.2％、7.1％等。可见，生物功能尚处于未知状态的唾液蛋白质仍占有相当大的比例，需要进一步研究挖掘，且意义重大。新近研究证实，大通量、大精度的蛋白组学技术的应用，使唾液蛋白质生物标记用于疾病的早期诊断预防、生物蛋白质靶向治疗、预后监测判断等均成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种安全可靠、有效率高的基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于‑80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI‑TOF‑TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI‑5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对肝癌肝郁证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，肝癌肝郁证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q9Y661，基因注释为Heparan sulfate glucosamine 3‑O‑sulfotransferase 4；2)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembrane protein 198；3)检索号为P11684，基因注释为Uteroglobin；4)检索号为P0CG06，基因注释为Ig lambda‑3 chain C regions；5)检索号为P0CG39，基因注释为POTE ankyrin domain family member J；6)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestro heat‑like repeat family member 5；7)检索号为P31949，基因注释为Protein S100‑A11；8)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin‑1；9)检索号为P01764，基因注释为Ig heavy chain V‑III region 23；10)检索号为P54687，基因注释为Branched‑chain‑amino‑acid aminotransferase,cytosolic；11)检索号为P01743，基因注释为Ig heavy chain V‑I region HG3；...

【技术特征摘要】
1.基于唾液蛋白质组学的肝癌肝郁证生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对肝癌肝郁证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，肝癌肝郁证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q9Y661，基因注释为Heparansulfateglucosamine3-O-sulfotransferase4；2)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembraneprotein198；3)检索号为P11684，基因注释为Uteroglobin；4)检索号为P0CG06，基因注释为Iglambda-3chainCregions；5)检索号为P0CG39，基因注释为POTEankyrindomainfamilymemberJ；6)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestroheat-likerepeatfamilymember5；7)检索号为P31949，基因注释为ProteinS100-A11；8)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；9)检索号为P01764，基因注释为IgheavychainV-IIIregion23；10)检索号为P54687，基因注释为Branched-chain-amino-acidaminotransferase,cytosolic；11)检索号为P01743，基因注释为IgheavychainV-IregionHG3；12)检索号为P04632，基因注释为Calpainsmallsubunit1；13)检索号为Q9NPC1，基因注释为LeukotrieneB4receptor2；14)检索号为Q9BPV8，基因注释为P2Ypurinoceptor13；15)检索号为Q8IZF2，基因注释为ProbableG-proteincoupledreceptor116；16)检索号为P42126，基因注释为Enoyl-CoAdeltaisomerase1,mitochondrial；17)检索号为P08637，基因注释为LowaffinityimmunoglobulingammaFcregionreceptorIII-A；18)检索号为P83593，基因注释为IgkappachainV-IVregionSTH(Fragment)；19)检索号为P04179，基因注释为Superoxidedismutase[Mn],mitochondrial；20)检索号为P49221，基因注释为Protein-glutaminegamma-glutamyltransferase4；21)检索号为Q8NDA2，基因注释为Hemicentin-2；22)检索号为Q96JC1，基因注释为Vam6/Vps39-likeprotein；23)检索号为P41439，基因注释为Folatereceptorgamma；24)检索号为P01877，基因注释为Igalpha-2chainCregion；25)检索号为Q96L46，基因注释为Calpainsmallsubunit2；26)检索号为P01876，基因注释为Igalpha-1chainCregion；27)检索号为P05109，基因注释为ProteinS100-A8；28)检索号为P06702，基因注释为ProteinS100-A9；29)检索号为P46939，基因注释为Utrophin；30)检索号为P01624，基因注释为IgkappachainV-IIIregionPOM；31)检索号为Q14508，基因注释为WAPfour-disulfidecoredomainprotein2；32)检索号为P04181，基因注释为Ornithineaminotransferase,mitochondrial；33)检索号为O95274，基因注释为Ly6/PLAURdomain-containingprotein3；34)检索号为P01040，基因注释为Cystatin-A；35)检索号为P01834，基因注释为IgkappachainCregion；36)检索号为P08118，基因注释为Beta-microseminoprotein；37)检索号为P01598，基因注释为IgkappachainV-IregionEU；38)检索号为Q9UGM3，基因注释为Deletedinmalignantbraintumors1protein；39)检索号为P22532，基因注释为Smallproline-richprotein2D；40)检索号为P01623，基因注释为IgkappachainV-IIIregionWOL；41)检索号为P30048，基因注释为Thioredoxin-dependentperoxidereductase,mitochondrial；42)检索号为P15328，基因注释为Folatereceptoralpha；43)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；44)检索号为P01770，基因注释为IgheavychainV-IIIregionNIE；45)检索号为P13473，基因注释为Lysosome-associatedmembraneglycoprotein2；46)检索号为Q6P995，基因注释为ProteinFAM171B；47)检索号为Q6UW32，基因注释为Insulingrowthfactor-likefamilymember1；48)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B；49)检索号为P29034，基因注释为ProteinS100-A2；50)检索号为P35326，基因注释为Smallproline-richprotein2A；51)检索号为Q5JS37，基因注释为NHLrepeat-containingprotein3；52)检索号为Q9NRK6，基因注释为ATP-bindingcassettesub-familyBmember10,mitochondrial；53)检索号为O95497，基因注释为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正治，丁峰，曹美群，孙珂焕，黄飞娟，范大华，姚永超，
申请(专利权)人：深圳市老年医学研究所，吴正治，
类型：发明
国别省市：广东,44