一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法技术

本发明专利技术公开一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，包括以下步骤：ERα蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔及脾脏总RNA提取；RT‑PCR扩增VH和VL片段及scFv基因拼接；构建PCANTAB5E‑ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建噬菌体单链抗体库；ERα阳性的乳腺癌组织切片和ERα蛋白作为固相化抗原对抗体库进行亲和富集筛选；采用Phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法鉴定阳性克隆子。本发明专利技术建立了一种利用ERα阳性乳腺癌组织切片对噬菌体抗体库进行雌激素受体特异性筛选的方法，并利用phage‑ElLSA法和乳腺癌细胞涂片免疫化学相结合的方法来鉴定阳性克隆子，为噬菌体抗体库的筛选方法提供了新的思路。

A method for screening single chain antibody of estrogen receptor alpha by phage antibody library

The invention discloses a method of screening estrogen receptor alpha single chain antibody by using phage antibody library, including the following steps: ER alpha protein is used as immunogen to immunize New Zealand white rabbits and spleen total RNA extraction; RT PCR amplification VH and VL fragments and scFv gene splicing; construction of PCANTAB5E ScFv recombinant plasmid and recombinant plasmid to convert E.coli. TG1 receptive cells construct phage single chain antibody library; ER alpha positive breast cancer tissue section and ER alpha protein as solid phase antigen for antibody library affinity enrichment screening; Phage positive ElLSA method and breast cancer cell smear immuno chemical combination method to identify positive clones. The invention establishes a method for screening the estrogen receptor specific of the phage antibody library by using the ER alpha positive breast cancer tissue section, and identifies the positive clones by combining the phage ElLSA method with the immuno chemistry of the breast cancer cell smear, and provides a new way of thinking for the screening method of phage antibody library.

【技术实现步骤摘要】
一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法
本专利技术属于噬菌体抗体库筛选方法
，具体涉及一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法。
技术介绍
雌激素受体(estrogenreceptor,ER)作为一种生物标志物，它既是属核激素受体(nuclearreceptor,NR)蛋白的一种，又是属于具有激活功能的转录因子，目前发现的ER具有ERα、ERβ、ERγ三种亚型。近年来，研究者发现雌激素受体α(ERα)在大约70％的乳腺癌病例中都表现出高表达和高活性水平。ERa的表达与乳腺癌密切相关，特别是肿瘤的发展。例如，乳腺癌治疗中降低ERα表达往往会有更好的治疗效果。ER表达水平与内分泌治疗的疗效密切相关，ER检测有助于预测患者对内分泌治疗的反应，其检测结果将直接决定治疗方案的选择。准确检测和报告ER状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断非常重要，已成为乳腺癌病理诊断报告中必不可少的内容。免疫组织化学是目前ER检测的最佳方法。美国博士Smithm在1985年第一次将外源蛋白的抗原基因序列通过基因工程技术组装在噬菌体内部，随着噬菌体侵染宿主菌完成自我组装，噬菌体的外壳表面展示出了蛋白抗原决定簇(与噬菌体次要外壳蛋白PIII融合表达)，同时提出了噬菌体展示技术的概念。现如今噬菌体展示技术已经成为了筛选目的蛋白和目的基因强有力的工具，是一种继多克隆技术，单克隆技术之后更为重要的基因工程技术。该技术目前广泛应用于筛选多肽和蛋白质、抗体等物质，具有简便、高效、低成本等优点，该技术可以从广泛和随机的文库中筛选出与靶标蛋白结合高亲和力、高特异性的抗体。噬菌体抗体库的淘筛过程是文库的关键步骤，经典的抗原筛选方法即固相筛选，即将纯化抗原包被在如酶标板、亲和层析柱等固相介质上筛选一株特异性噬菌体，该方法是将非特异性的噬菌体进行洗脱，特异性的重组噬菌体进行富集的过程。但有时候由于位点封闭不完全，会出现非特异性噬菌体结合的情况且筛选出的阳性克隆未能在免疫组化结果上显现出较好的结合能力。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α(ERα)单链抗体的方法为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，包括以下步骤：(1)采用雌激素受体α(ERα)蛋白作为免疫原免疫实验动物新西兰大白兔，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；(2)设计简并引物扩增重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)，采用SOE-PCR拼接VH和VL为scFv基因；(3)对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB-ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coliTG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT-A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；(4)初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，进行三轮富集筛选，富集得到的三级噬菌体单链抗体库与结合在固相载体上的ERα蛋白再进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；(5)特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coliTG1，梯度稀释涂布2×YT-A，挑取单克隆制备噬菌体上清，采用phage-ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上的乳腺癌细胞(T47D)一同孵育，细胞免疫化学鉴定阳性克隆子。步骤(1)中，所述ERα蛋白预先经EDTA抗原热修复处理后再作为免疫原，该处理使得制备的抗体对免疫组化检测更具有针对性，其抗体核定位更清晰，背景更干净，无非特异性着色。步骤(2)中，共设计9对引物扩增VL基因，4对引物扩增VH基因，VL基因和VH基因中间添加一段柔性多肽链Linker相连接，所述多肽链Linker氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。步骤(3)中，所述PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行sfiI和NotI双酶切处理，采用T4DNA电转专用连接酶连接构建PCANTAB-ScFv重组质粒，电转化大肠杆菌电转专用感受态细胞TG1，按照MOi＝100:1加入滴度大于1012pfu/ml的辅助噬菌体M13KO7，构建初级噬菌体单链抗体库，初级噬菌体单链抗体库采用双层琼脂法计算噬菌体滴度，随机挑取单克隆菌液PCR计算重组率。步骤(4)中，初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，弃去未与组织片结合的噬菌体，将结合的噬菌体用Gly-HCL洗脱下来进行扩增，进行三轮富集筛选得到三级噬菌体单链抗体库；三级噬菌体单链抗体库与结合在酶标板上的ERα蛋白一同孵育，增加洗脱次数洗去未结合的噬菌体，最大限度的富集与ERα蛋白结合的噬菌体，进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库。步骤(5)中，特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coliTG1，梯度稀释涂布2×YT-A，挑取30颗单克隆制备噬菌体上清作为一抗，HRP标记鼠抗M13KO7为二抗，，采用phage-ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的7株单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上乳腺癌细胞(T47D)一同孵育，HRP标记鼠抗M13KO7为二抗，经DAB染色，苏木素复染，PBS返蓝步骤后，观察细胞涂片鉴定阳性克隆子。本专利技术所述利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，具体如下：1)ERα蛋白实验兔的免疫及脾脏总RNA提取：ERα重组蛋白由实验室制备纯化，采用EDTA抗原修复液热修复处理稀释好的ERα蛋白，标记为ERα-AR。修复好的ERα蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔，免疫前耳缘静脉取血为阴性对照。首次免疫结束后每两周进行一次免疫，第三次免疫结束后耳缘静脉取血，ELISA法检测抗体效价，效价达到105后进行最后一次加强免疫，三天后处死动物，提取脾脏细胞，获得总RNA，以纯化的RNA为模板用Oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA。2)RT-PCR扩增VH和VL片段及scFv基因拼接：根据已发表的兔源抗体重链和轻链可变区基因序列，共设计9对引物扩增VL基因，4对引物扩增VH基因。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环后72℃5min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶回收后使用重叠PCR法拼接成为scFv。PCR产物经1％琼脂糖凝胶回收放于-20℃保存。3)初级噬菌体单链抗体库的构建及鉴定:按照英国NEB公司双酶切体系，对pCABTAB5E噬菌体质粒和scFv片段分别进行sfiI和NotI酶切处理，酶切产物电泳回收后使用T4DNA电转专用连接酶连接。连接产物电转化大肠杆菌电转专用感受态细胞TG1，转化液加入2×YT培养基，37℃摇床复苏震荡1h，取出100ul菌液，10梯度倍比稀释涂布2×YT-A平板，其余转化液按照MOi＝100:1加入辅助噬菌体M13KO7，37℃水浴30min，37℃摇床培养30min。离心弃上清，用100ml2×YT-AK培养基重悬沉淀，37℃摇床震荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：其包括以下步骤：（1）采用ERα蛋白作为免疫原免疫实验动物，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；（2）设计简并引物扩增重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，采用SOE‑PCR拼接VH和VL为scFv基因；（3）对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB‑ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coli TG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT‑A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；（4）初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，进行三轮富集筛选，富集得到的三级噬菌体单链抗体库与结合在固相载体上的ERα蛋白再进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；（5）特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coli TG1，梯度稀释涂布2×YT‑A，挑取单克隆制备噬菌体上清，采用phage‑ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上的乳腺癌细胞T47D一同孵育，细胞免疫化学鉴定阳性克隆子。...

【技术特征摘要】
1.一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：其包括以下步骤：（1）采用ERα蛋白作为免疫原免疫实验动物，三次免疫结束后耳缘静脉取血，采用ELISA法检测血清效价，效价达到要求后加强免疫三天后，处死实验动物，无菌条件下提取脾脏总RNA，逆转录合成cDNA；（2）设计简并引物扩增重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL，采用SOE-PCR拼接VH和VL为scFv基因；（3）对PCANTAB5E噬菌体质粒和scFv基因分别进行双酶切处理，酶连构建PCANTAB-ScFv重组质粒，重组质粒电转化E.coliTG1感受态细胞构建初级噬菌体单链抗体库，转化液梯度稀释并涂布2×YT-A平板计算库容，挑取单克隆菌液PCR计算重组率；（4）初级噬菌体单链抗体库与ERα阳性的乳腺癌组织切片一同孵育，进行三轮富集筛选，富集得到的三级噬菌体单链抗体库与结合在固相载体上的ERα蛋白再进行两轮富集筛选，得到亲和力高、特异性强的特异性噬菌体单链抗体库；（5）特异性噬菌体单链抗体库侵染E.coliTG1，梯度稀释涂布2×YT-A，挑取单克隆制备噬菌体上清，采用phage-ElLSA法进行初步鉴定，选取OD450较高的单克隆再次制备噬菌体上清，与固定在载玻片上的乳腺癌细胞T47D一同孵育，细胞免疫化学鉴定阳性克隆子。2.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述实验动物为新西兰大白兔。3.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述ERα蛋白预先经EDTA抗原热修复处理后再作为免疫原。4.根据权利要求1所述的一种利用噬菌体抗体库筛选雌激素受体α单链抗体的方法，其特征在于：步骤（2）中，共设计9对引物扩增VL基因，4对引物扩增VH基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王航，张芸，孟春，高蕊，陈思诗，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35