一种海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯-I的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯‑I的制备方法和应用。如式（Ⅰ）所示的海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯‑I在制备抗外周及神经炎症和抗神经退行性疾病药物的应用。

Preparation and application of a marine fungus Aspergillus lactone butyllactone -I

The invention relates to a preparation method and application of a marine fungus Aspergillus butylene compound butylene I. The application of I, a metabolic product of Aspergillus oryzae, to prepare anti peripheral and neuroinflammatory and anti neurodegenerative drugs, is shown in the form of Aspergillus oryzae.

【技术实现步骤摘要】
一种海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯-I的制备方法和应用
本专利技术涉及微生物
，具体地，涉及一种海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯-I的制备方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默症（AD）和帕金森综合征（PD）等神经退行性疾病严重威胁老年人身心健康，目前的研究结果表明，它们的发生与氧化应激和神经炎症有着密切关系。β-淀粉样蛋白（Aβ）、磷酸化微管蛋白（Tau）、非结合铁的堆积以及多巴胺（DA）的代谢等，能刺激活性氧簇（ROS）的生成，引起氧化应激，损伤神经元，引起认知或运动功能障碍。氧化应激状态的持续激活能够进一步促进Aβ和磷酸化Tau的聚集和沉积和线粒体损伤等，最终导致神经退行性疾病的发生并加速其病理进程。抗氧化剂可以清除大脑中的氧化物并防止氧化物的形成，抑制促氧化酶活性，中和自由基，或通过螯合促进自由基生成的过渡金属离子，减轻炎症反应，进而起到保护神经的作用，缓解患者病症。现有的应用于临床的阿尔茨海默症治疗药物主要是AChE抑制剂，包括毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明、安吖啶他克林及哌啶多奈哌齐等，用于治疗帕金森氏症的药物主要是左旋多巴、金刚烷胺、司来吉兰等，这些药物价格昂贵，并且除了石杉碱甲外均具有一定的毒副作用。因此，筛选毒性低、活性好、产量高的天然来源的抗氧化-抗炎-神经保护剂对于神经退行性疾病的预防和治疗具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的另一目的在于提供上述丁内酯-I的制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一般情况下，丁内酯类化合物具有清除DPPH自由基的作用，但是本专利技术的专利技术人发现，丁内酯类化合物丁内酯-I除了该作用外，还具有清除ABTS自由基和OH自由基的作用；在20～100μM的浓度范围内，该化合物可抑制RAW264.7和BV-2细胞内NO和活性氧的产生，这与该化合物能够显著抑制细胞内iNOS和COX-2蛋白的表达有关，因此，其具有较好的抗炎、抗氧化作用，在制备抗外周及神经炎症药物方面具有广泛的应用前景。优选地，上述丁内酯-I在抑制外周和神经细胞内NO和活性氧的产生方面的应用。本专利技术的专利技术人发现，丁内酯-I对MPP+诱导的神经细胞损伤具有逆转作用，因此具有神经保护的作用，对神经退行性疾病具有潜在的较好的治疗作用。优选地，上述丁内酯-I在制备治疗阿尔茨海默症药物或帕金森综合症药物中的应用。本专利技术提供一种从海洋真菌土曲霉的代谢产物中制备丁内酯-I的方法。S1.发酵：将海洋真菌土曲霉C23-3接种于真菌液体培养基中静置发酵后，收集菌丝体和发酵液；S2.粗提：将步骤S1的发酵液经乙酸乙酯萃取后浓缩，菌丝体经有机溶剂超声提取后浓缩，将所得浓缩物合并后得粗提物；S3.分离纯化：将步骤S2的粗提物进行减压硅胶柱梯度层析，经硅胶薄层层析检测，将含有目标物质的洗脱组分继续进行凝胶柱层析、反相硅胶柱和反相相制备液相色谱分离纯化，即得所述丁内酯-I；其中，所述海洋真菌土曲霉C23-3于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心，保藏编号为GDMCCNo.60316。本专利技术在对海洋真菌土曲霉C23-3的代谢产物进行分析时发现，其代谢产物中含有丁内酯-I，通过收集菌丝液和发酵液，并粗提和纯化其中的丁内酯-I可得到高纯度的丁内酯类化合物。本专利技术所使用的真菌液体培养基为常规的的培养基，优选地，步骤S1所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁400～600mL，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8g，蒸馏水400～600mL，pH值6～8。优选地，步骤S1中的发酵条件为静置发酵18～25天。优选地，步骤S2中乙酸乙酯萃取的次数为2～4次。本领域常用的有机溶剂均可用于本专利技术S2中对菌丝体进行提取，优选地，步骤S2中有机溶剂为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种。优选地，步骤S2中有机溶剂超声提取的次数为2～4次。优选地，步骤S3中减压硅胶柱梯度层析的条件为：依次用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集以洗脱液体积比100:0～0:100梯度的洗脱的组分。优选地，硅胶薄层层析的条件为：硅胶薄层层析板上展开剂为体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯溶液，收集Rf值为0.2～0.8的混合物组分。优选地，凝胶柱层析的流动相为甲醇，流速0.5～1mL/min。优选地，反相硅胶柱为ODS反相硅胶柱层析，流动相为体积比2:3～3:2的甲醇-水。优选地，反相制备液相色谱纯化的条件为：流动相为体积比1:3～3:2的甲醇-水，在硅胶柱填充10～15g反相硅胶，流速为4～8mL/min，收集保留时间为5～20min的主峰，得到的收集物即为所述丁内酯-I。为了提高海洋真菌土曲霉C23-3的代谢产物中丁内酯-I的产量，本专利技术经过多次试验，找到了一种化学诱导剂ZnCl2。优选地，步骤S1的真菌液体培养基中还含有诱导剂ZnCl2，所述诱导剂ZnCl2的含量为0.0001～1mM/mL。上述诱导剂ZnCl2在提高海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯-I的产量的应用也在本专利技术的保护范围内。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术发现丁内酯-I除可清除DPPH自由基外，还可较好地清除ABTS自由基和OH自由基，具有较好的抗氧化、抗炎以及神经保护的活性，在制备抗神经退行性疾病药物方面具有良好的应用前景。同时，本专利技术提供的丁内酯-I的制备方法，可成功制备得到该丁内酯-I，方法简单，易于实现大规模生产；且还可通过诱导剂的添加来优化培养条件，从而大幅提高其产量。附图说明图1为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I的核磁共振氢谱。图2为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I的核磁共振碳谱。图3为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I的细胞毒性作用和对LPS诱导的BV-2(A)和RAW264.7(B)胞内NO的抑制作用。图4为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I对LPS诱导的BV-2(A)和RAW264.7(B)胞内ROS的抑制作用。图5为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I对RAW264.7胞内iNOS(A)和COX-2(B)蛋白表达的影响。图6为本专利技术提供的丁内酯类化合物丁内酯-I对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用。图7为海洋真菌土曲霉C23-3化学诱导前后乙酸乙酯提取物的HPLC对比分析谱图。具体实施方式下面将通过具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1海洋真菌土曲霉C23-3丁内酯类化合物丁内酯-I的制备方法本实施例提供一种丁内酯-I的制备方法，具体如下：发酵：将土曲霉（Aspergillusterreus）GDMCCNo.60316接种于真菌液体培养基中静置发酵18～25天，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；其中，所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁400～600mL，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8g，蒸馏水400～600mL，pH值6～8。2.粗提：将步骤1获得的发酵液经乙酸乙酯超声萃取3次并浓缩，将步骤1获得的菌丝体用甲醇超声提取并减压浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如式（

【技术特征摘要】
1.如式（）所示的海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯-I在制备抗外周及神经炎症药物的应用，。2.根据权利要求1所述丁内酯-I在抑制细胞内NO和活性氧的产生方面的应用。3.如式（）所示的海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯-I在清除ABTS自由基和OH自由基方面的应用。4.如式（）所示的海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯-I作为MPP+诱导的神经细胞损伤逆转剂在制备治疗神经退行性疾病药物中应用。5.根据权利要求4所述丁内酯-I在制备治疗阿尔茨海默症药物或帕金森综合症药物中的应用。6.一种如式（）所示的海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯-I的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：S1.发酵：将海洋真菌土曲霉C23-3接种于真菌液体培养基中静置发酵后，收集菌丝体和发酵液；S2.粗提：将步骤S1的发酵液经乙酸乙酯萃取后浓缩，菌丝体经有机溶剂超声提取后浓缩，将所得浓缩物合并后得粗提物；S3.分离纯化：将步骤S2的粗提物进行减压硅胶柱梯度层析，经硅胶薄层层析检测，将含有目标物质的洗脱组分继续进行凝胶柱层析、反...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翼，聂影影，宋采，千忠吉，张永平，雷晓凌，李亚娟，洪鹏志，杨静明，杨文聪，冯妍，
申请(专利权)人：广东海洋大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44