涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）菌株X35及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35及其在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面的应用。本发明专利技术的菌株X35耐盐、耐碱，且能够产生稳定的酶活高的木聚糖酶。

X35 strain of Nestelenkos (Nesterenkonia) and its application

The invention relates to a newly isolated strain of Nestelenkos strain X35 and its application in food, environmental protection, pharmaceutical industry, fermentation industry and agricultural production. The strain X35 of the invention is salt tolerant and alkali resistant, and can produce stable xylanase with high enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其应用
本专利技术涉及一株新分离的涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面中的应用。
技术介绍
1997年Stackebrandt等[4]提出具有普通细菌形态的高G+C含量的革兰氏阳性球菌和杆菌与传统的放线菌一起同属于放线细菌纲(Actinobacteriaclassis)这一新的分类体系。随着现代实验技术的不断提高，放线菌尤其是具普通细菌形态的放线细菌的研究高速发展，每年都有多个新的种、属被发现。到2003年止，在Actinobacteriaclassis已发现的近160余个属中，有近一半是具有普通细菌形态的。在盐湖、盐碱地等高盐高碱条件下生长的微生物，由于有极为特殊的生理结构、代谢机制和遗传基因，能产生多种具独特生物活性的物质，可应用于生物环保、食品、制药、发酵工业、农业生产等方面，因而引起人们的广泛关注[5]，现已成为国际、国内研究的热门领域，而高盐碱环境中的放线细菌不但是研究生物进化和系统发育的极好材料，而且是一类极具开发前景的微生物资源。嗜盐微生物是指在高盐条件下生长的细菌，它主要生长在盐湖、死海、盐场等浓缩海水中，以及腌鱼、盐兽皮等盐制品上。嗜盐微生物作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注。理论研究方面，由于该类生物长期生活在高盐环境下，形成了具有极为特殊的细胞结构和生理机能[6]，故其嗜盐机制、细胞结构和特殊的生理机能是研究者们感兴趣的话题。实际应用方面，嗜盐菌在盐田中的应用，有利于提高原盐产量[7]；在高盐度废水处理和生物降解石油烃、有机磷和重金属等污染物中也具有广阔的应用前景[8，9]。已知涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)是放线杆菌纲、微球菌亚目、微球菌科中的一个属，该属菌株被描述为专性好氧的中度嗜盐菌，多为球状或短杆状，偶尔可见分支[2,3]。该属已有2个有效发表种:喜盐涅斯捷连科氏菌(N.halobia)和回音湖涅斯捷连科氏菌(N.lacusekhoensis)[1]。但目前国内外对涅斯捷连科氏菌属的微生物的相关报道相对较少，该属的其他菌株及其生物学特性还有待发现和研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35。本专利技术还提供了本专利技术的涅斯捷连科氏菌属菌株X35在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面的应用。本专利技术的涅斯捷连科氏菌属菌株X35耐盐、耐碱，且能够产生稳定的酶活高的木聚糖酶。附图说明图1示出了对32株菌株所产生的木聚糖酶酶活测定的结果。图2示出了对12株菌株所产生的木聚糖酶、纤维素酶和细胞壁酶酶活测定的结果。图3是菌株X35的产木聚糖酶的曲线图。图4示出了菌株X35在20℃下于RM培养基中培养7天后观察到的(图4-1)以及经革兰氏染色后观察到的(图4-2)形态特征。图5示出了盐浓度对菌株X35的生长(图5-1)和产木聚糖酶(图5-2)的影响，以及pH对菌株X35的生长(图5-3)和产木聚糖酶(图5-4)的影响。图6示出了菌株X35所产生的木聚糖酶粗酶液经凝胶过滤层析纯化后的洗脱图谱(图6-1)，以及其在上样前和洗脱后的Native-PAGE检测图谱(图6-2)。图7示出了菌株X35所产生的木聚糖酶进一步经过DEAE弱阴离子交换层析后的洗脱图谱(图7-1)，以及洗脱液经SDS-PAGE检测的结果图(图7-2)。图8示出了pH(图8-1)、温度(图8-2)以及金属离子(图8-3)对木聚糖酶活性的影响。具体实施方式如上所述，本专利技术提供了一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35。所述菌株X35的菌落形态呈圆形、表面拱起湿润、橙黄色、不透明。所述菌株X35的16SrDNA的登录号为JX122587。所述菌株X35在以秸秆粉为唯一碳源的发酵液进行培养时，可在pH7-12的条件下生长，最适生长pH是10；可生长的盐浓度是2％～7％(w/v)，最适生长盐浓度是6％(w/v)。此外，所述菌株X35可产生酶活最高达124.578U/ml的木聚糖酶。所述菌株X35所产生的木聚糖酶在pH7-9之间稳定性好，最适反应pH为7，最适反应温度为50℃，在30℃以下稳定性好。所述菌株X35所产生的木聚糖酶的最适底物是木聚糖，对滤纸、燕麦秸秆和麸皮的特异性弱，对羟甲基纤维素、淀粉和果胶没有酶活性。所述菌株X35所产生的木聚糖酶可被K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Co2+或Ca2+激活，并且可被Hg+和Mg2+抑制。所述菌株X35于2016年9月30日以登录号CGMCC13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，其被分类命名为涅斯捷连科氏菌(Nesterenkoniasp.)。本专利技术还提供了本专利技术的涅斯捷连科氏菌属菌株X35在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产中的应用。具体地，本专利技术的菌株X35可用于制备猪饲料、鸡饲料和奶牛饲料。含有本专利技术菌株X35的饲料可以使细胞内养分释放、降低食糜黏度、减少肠道微生物发酵、提高养分利用率以及提高动物健康水平。本专利技术的菌株X35还可用于降解石油烃、芳香烃衍生物和有机磷等污染物，处理高盐度废水。利用本专利技术的菌株X35降解环境中的污染物具有成本低、效率高、以及不易造成二次污染等优点。本专利技术的菌株X35还可用于可降解生物材料的开发，从而应用于医学领域，例如外科手术、病人碳源外充。此外，本专利技术的菌株X35还可以用于制备食品添加剂和乳化剂等，从而应用于食品和制药工业。以下通过具体实施例来说明本专利技术的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本专利技术的内容仅限于具体实施例。实施例1：菌株的分离纯化1.1样品涂布将采自青海湖的入湖口---黑马河及其两个子湖---尕海与耳海的土样与泥样的三个平行样品分别混匀后，各称取10g，制成含菌悬浊液，吸取0.2ml含菌悬浊液，按10-2～10-6梯度进行稀释，涂布至NaCl浓度分别为1.5﹪、10﹪和30﹪的培养基上。取采自尕海与耳海的水样200μL，采自黑马河的水样100μL，直接涂布至上述培养基上。每个样品做三个平行。1.2菌落的计数将涂布后的平板置于GXZ型智能光照培养箱(宁波东南仪器有限公司)中，10℃下连续培养20d。待菌落生长稳定后，选取菌落数在30～300之间的平板对分离的菌落进行计数(参照国家计数标准)。1.3菌株的保存挑取单个菌落至一新平板，使用实验室常规方法平板划线法，进行多次分离，在分离纯化的各菌株中加入灭菌的液体石蜡于-20℃下保存。1.4菌株的筛选在不同的盐浓度、温度和pH条件下，对上述得到的菌株进行进一步筛选。1.4.1不同盐浓度条件下的筛选按照m/v比例分别配置2.5％、5％、10％、15％和20％五个盐浓度梯的RM培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl0.2％、CaCl20.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、琼脂1.8％、pH9.0)，将分离得到的各菌株分别培养于所述不同盐浓度的RM培养基上，每个菌株做三个平行，置于10℃环境下恒温培养，观察其长势，得出各菌株的最适生长盐浓度及可生长的盐浓度范围，并进行统计分析。1.4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35，其以登录号CGMCC13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

【技术特征摘要】
1.涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35，其以登录号CGMCC13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。2.权利要求1的菌株X35，其16SrDNA的登录号为JX122587。3.权利要求2的菌株X35，其在以秸秆粉为唯一碳源的发酵液中的最适生长盐浓度为6％(w/v)；最适生长pH是10。4.权利要求3的菌株X35，其产生的木聚糖酶的最高酶活达到124.578U/ml。5.权利要求1的菌株X35，其产生的木聚糖酶的最适反应pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢占玲，雷洁琼，余传鑫，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海,63