一株短杆菌及其用于农田重金属污染原位修复的方法技术

本发明专利技术提供一株短杆菌及其用于农田重金属污染原位修复的方法，该短杆菌的分类命名为：短杆菌(Brevibacterium sp)GRINM L2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13064。该菌可在高浓度重金属离子存在下，高效地将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，可用于重金属污染农田的修复。

Brevis brevis and its method for in situ remediation of heavy metal pollution in farmland

The present invention provides a strain of Bacillus brevis and its in situ remediation of heavy metal pollution in farmland. The short bacilli is named Brevibacterium sp GRINM L2, and preserved in the general microorganism center of the Chinese microbe preservation management committee. The address is No. 1, No. 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, China Preservation of the Institute of Microbiology, Academy of Sciences, September 29, 2016: preservation number: CGMCC No.13064. The bacteria can efficiently transform insoluble phosphate into soluble phosphate in the presence of high concentration of heavy metal ions and can be used for remediation of heavy metal contaminated farmland.

【技术实现步骤摘要】
一株短杆菌及其用于农田重金属污染原位修复的方法
本专利技术属于应用微生物学科领域，涉及一株短杆菌，该短杆菌可在高浓度重金属离子存在下存活，将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，及该短杆菌用于农田重金属污染原位修复的方法。
技术介绍
我国农田重金属污染严重，现有治理方式主要以化学钝化为主，而相当一部分化学钝化剂(如石灰，硫化钠等)均为杀菌剂，在开展农田重金属污染治理过程中容易杀灭土壤中的土著微生物群落，造成土壤板结，肥力下降等问题。另一方面，我国有74％的耕地土壤缺磷，由于施用的磷肥极易被固化，造成95％及其以上的磷以难以利用的无效形式存在，农田磷肥往往过量投加，进一步造成了土壤的板结。因此，若能利用微生物的解磷能力，将受重金属污染的农田中，因过量磷肥投加而形成的不被利用的磷转化为可溶性磷，一方面可溶性磷可以和重金属形成不溶磷酸盐，原位固化重金属，另一方面可以为植物生长提供缓释而有效的磷。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一株短杆菌属短杆菌菌种，该菌可在高重金属离子浓度存在下，高效地将磷酸钙中的磷释放出来，形成PO43-，而PO43-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。本专利技术的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。本专利技术的第三个目的是提供一种利用该菌原位修复治理农田重金属污染的方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供一株短杆菌，该菌的分类命名为短杆菌(Brevibacteriumsp.)GRINML2，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCCNo.13064。如上所述菌株的菌落特征为：在固体培养基上31℃生长较快，3天后菌落直径为3mm，解磷圈直径为5mm，菌落呈规则圆形，颜色为蓝色，质地致密，透明圈为圆形，紧贴着菌落生长。如上所述菌株可在高重金属离子浓度存在下，高效的将磷酸钙中的磷释放出来，形成PO43-，而PO43-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。用于富集、分离培养上述短杆菌的培养基，包括：该培养基的配方为：10重量份葡萄糖，5重量份磷酸钙，0.3重量份七水硫酸镁，0.5重量份硫酸铵，0.3重量份氯化钠，0.3重量份氯化钾，0.002重量份硫酸锰，0.03重量份七水硫酸亚铁，1重量份酵母提取物，1000重量份蒸馏水，pH7.0～7.5上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。如上所述短杆菌的富集、分离培养方法，将上述短杆菌菌种接种入如上所述的培养基中，在30-33℃的培养温度下，100rpm摇床培养至菌浓度为108个/mL。本专利技术还提供一种利用如上所述短杆菌进行农田重金属污染原位修复的方法，将所述短杆菌的菌种，采用如上所述的方法进行富集培养后，接种至重金属污染农田，接种量为每m3体积2-4L，优选为3L。当修复效果不好或有新的重金属污染进入农田时，可补加如上所述的培养基。如上所述短杆菌的获得方法为：(1)培养基用于分离菌种的固体培养基：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，1L水，pH7.0～7.5。用于富集菌种的液体培养基：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，1L水，pH7.0～7.5。上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。(2)菌株的富集分离本短杆菌分离的原始土壤样品来自于河南省某铅锌矿区周边耕地，该耕地连续三年施用磷肥，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤。在离地表10～20cm处，完整挖出植物的根，采用抖根法抖掉块状较大的土块，将完整的根须连同粘连的根须土装入无菌封口袋种，在24h内带回实验室在冰箱于4℃保存备用。取根须将上面粘连的土用刀片一点点的刮下来，颗粒稍大的碾碎，将从玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根须土壤收集并混合均匀。准确称量35g的土放入200mL的去离子水中于250mL的锥形瓶，并加入少量的剪碎的根须。300r/min磁力搅拌破碎土壤40min，静置分层。取上清液观察，菌量较少。取20mL上清液加入到200mL上述液体培养基中，在250mL锥形瓶中在31℃，160r/min的摇床富集培养三天，浓缩至菌液的浓度达到108个/mL，取出摇瓶，取上清液分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，六个梯度的稀释。然后取20μL涂布于事先倒好的固体培养基平板上，每个浓度重复三次，于31℃恒温固定床上培养三天，每天观察平板菌落的变化。(3)菌株分离鉴定将富集的短杆菌涂布于上述培养基，并挑单菌落进行进一步平板划线。纯化分离后的单菌落利用扫描电镜进行菌种形态观察；采用16SrDNA克隆文库技术对分离纯菌株进行鉴定，鉴定结果表明该菌株属短杆菌(Brevibacteriumsp.)属。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一株短杆菌属短杆菌(Brevibacteriumsp.)GRINML2菌株，该菌该菌种可在高重金属离子浓度存在下，高效地将磷酸钙中的磷释放出来，形成PO43-，而PO43-可以和重金属离子如铜、铅、锌等形成不溶金属磷酸盐。附图说明图1为本专利技术提供的短杆菌(Brevibacteriumsp.)GRINML2的扫描电镜照片。图2为本专利技术提供的短杆菌的解磷效果。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术所提供的短杆菌已进行保藏，该菌的分类命名为短杆菌(Brevibacteriumsp.)GRINML2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCCNo.13064。本专利技术所述短杆菌的培养方法如下：首先配制富集培养短杆菌的培养基(液体培养基)：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，1L水，pH7.3。固体培养基：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，1L水，pH7.0～7.5。上述培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌30min备用。本专利技术所获得的含短杆菌土样，来自于河南省某铅锌矿区周边耕地，该耕地连续三年施用磷肥，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤。在离地表10～20cm处，完整挖出植物的根，采用抖根法抖掉块状较大的土块，将完整的根须连同粘连的根须土装入无菌封口袋种，在24h内带回实验室在冰箱于4℃保存备用。取根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株短杆菌，其特征在于，该菌的分类命名为短杆菌(Brevibacterium sp)GRINM L2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13064。

【技术特征摘要】
1.一株短杆菌，其特征在于，该菌的分类命名为短杆菌(Brevibacteriumsp)GRINML2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCCNo.13064。2.用于富集、分离培养如权利要求1所述短杆菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：10重量份葡萄糖，5重量份磷酸钙，0.3重量份七水硫酸镁，0.5重量份硫酸铵，0.3重量份氯化钠，0.3重量份氯化钾，0.002重量份硫酸锰，0.03重量份七水硫酸亚铁，1重量份酵母提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴宇，张明江，谷启源，温建康，
申请(专利权)人：北京有色金属研究总院，
类型：发明
国别省市：北京,11