测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于解吸附铝盐吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原的解吸附剂，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。基于该解吸附剂，本发明专利技术建立了一种测定铝盐吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原含量的方法。该方法涉及的样品处理过程减少了铝盐佐剂对吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原含量检测的干扰，具有重复性高、准确度高、特异性好的特点，为铝盐吸附型DTap‑IPV疫苗的质量控制提供参考。

【技术实现步骤摘要】
测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法
本专利技术属于生物医药
，具体地说，涉及一种测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法。
技术介绍
脊髓灰质炎D-抗原是DTap-IPV疫苗(百白破-脊髓灰质炎联合疫苗)的主要有效成分，其有效成分含量与疫苗的保护效果有关，因此，D-抗原含量是DTap-IPV疫苗质量控制的重要一项。目前，D-抗原含量的检测采用酶联免疫吸附法，其原理是将脊髓灰质炎多抗吸附在酶联反应板上，使供试品中的待检抗原与其发生特异结合，再加入酶标抗体，使其与吸附在酶标板上的抗原结合形成免疫复合物，通过酶反应底物在酶的作用下产生显色反应，并根据颜色变化对供试品种的抗原做定量分析。但是其检测结果易受佐剂等非抗原物质的干扰。而DTap-IPV疫苗为氢氧化铝吸附型疫苗。氢氧化铝佐剂与抗原表面携带的负电荷基团发生共价或配位结合，以颗粒的方式包裹抗原，与可溶性抗原一起形成沉淀，从而使复合物更具免疫性。氢氧化铝与抗原结合屏蔽了抗原表面的特异性结合位点，进而在抗原的体外检测过程中，抗原无法与酶联反应或酶标抗体上的特异抗体相结合，从而导致抗原检出量偏低。因此，有必要针对脊髓灰质炎病毒抗原与氢氧化铝佐剂之间的吸附，开发一种解吸附液，从而使其可以破坏抗原与佐剂之间的作用力，在短时间内解离抗原，并通过酶联免疫法对解离后的脊髓灰质炎病毒抗原进行准确定量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是准确检测出铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中脊髓灰质炎的D-抗原含量，进行有效地质量控制。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。所述柠檬酸盐溶液为5％-30％(优选20％)的柠檬酸钠溶液。所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选TritonX-100。所述表面活性剂在柠檬酸盐溶液中的终浓度为0.05％-0.2％，优选0.1％。此外，一些金属离子螯合剂、有机酸、乙二醇等物质可以针对抗原与佐剂之间存在的一种或几种相互作用力进行破坏，达到解离抗原的目的。上述物质可以替代表面活性剂用于解吸附剂制备中。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述解吸附剂为含有TritonX-100的20％柠檬酸钠溶液，TritonX-100的终浓度为0.1％。所述解吸附剂可按如下方法配制：①称取1gTritonX-100，用10mL纯化水溶解，混匀，即为10％TritonX-100溶液；②称取4g柠檬酸钠，用纯化水溶解，加入10％TritonX-1000.4mL，补加纯化水至20mL，即为解吸附剂。本专利技术还提供一种用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，其是利用所述解吸附剂处理待测疫苗，并测定混合液中的D-抗原含量。所述方法包括以下步骤：(1)将待测疫苗配制成溶液，并与解吸附剂混匀后孵育；(2)采用酶联免疫吸附法检测(1)所得混合液中的D-抗原含量。优选地，步骤(1)中用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为15-25EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:10-10:1的体积比混匀，在20-30℃下孵育0.5-18h。在本专利技术的一个具体实施方式中，用纯化水将待测疫苗配制成D-抗原含量为20EU/mL溶液，然后将溶液与解吸附剂按1:1的体积比混匀，在25℃下孵育2h。步骤(2)中采用酶联免疫吸附法对混合液中的D-抗原进行检测。本专利技术中，所述铝盐为氢氧化铝佐剂，即所述铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗为氢氧化铝吸附型疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供一种专属性强的用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，并基于该解吸附剂，建立了一种用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，该方法涉及的样品处理过程减少了铝盐佐剂对吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量检测的干扰，具有重复性高、准确度高、特异性好的特点，为铝盐吸附型DTap-IPV疫苗的质量控制提供参考。附图说明图1为本专利技术实施例2中96孔板布局图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本专利技术中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。实施例1用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂的制备本实施例提供的用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，可按如下方法配制得到：1、称取1gTritonX-100，用10mL纯化水溶解，混匀，即为10％TritonX-100溶液。2、称取4g柠檬酸钠，用纯化水溶解，加入10％TritonX-1000.4mL，补加纯化水至20mL，即为解吸附剂。实施例2测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法1、实验材料氢氧化铝吸附型DTap-IPV疫苗购自北京民海生物科技有限公司。脊髓灰质炎病毒抗体购自北京民海生物科技有限公司。吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗购自赛诺菲巴斯德公司，产品批号为NOA661M。2、实验方法2.1疫苗溶液的配制用纯化水将待测氢氧化铝吸附型DTap-IPV疫苗配制成D-抗原含量为20EU/mL溶液，然后将溶液与实施例1的解吸附剂按1:1的体积比混匀，25℃孵育2h，得到供试品，用于下一步D-抗原含量检测。2.2D-抗原含量测定采用酶联免疫吸附法进行脊髓灰质炎病毒D-抗原含量检测，具体如下：上样：向已包被20DU/mL脊髓灰质炎病毒抗体(一抗为牛多抗，购自北京民海生物科技有限公司)的96孔微孔板(图1)中，在1、2列加入参比品稀释液(除A1，A2外)100μl/孔，在A1、A2各加入预先稀释好的参比品200μl/孔，从A1、A2各取出100μl加入B排，并从B排梯度稀释至G排，G排弃去100μl，H排为空白对照(空白对照为样品稀释液)；再加入供试品100μl/孔，并做两孔平行，加完后轻轻振板混匀，盖好封板膜后置于37℃反应60min。其中，参比品稀释液为含有1％BSA的0.01MPBS，参比品为经过国际标准品标定的脊髓灰质炎抗原。用洗涤液洗净微孔板，每孔加入稀释好的酶标抗体(兔多抗，购自北京民海生物科技有限公司，酶标抗体1:50000倍稀释)100μl/孔，加完后轻轻振板混匀，盖好封板膜后置于37℃避光反应60min。用洗涤液洗净微孔板，每孔加入TMB显色液50μl，室温显色10～15min。每孔加入50μl2M硫酸终止反应；轻轻振荡混匀，10分钟内用酶标仪于450/630nm下读数。结果计算：以参比品抗原浓度作为横坐标，参比品吸光度为纵坐标，做四参数方程：Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D式中，A：当X趋向于0时的渐近线(OD最小值)，D：当X趋向于无穷时的渐近线(OD最大值)，X：浓度(DU/ml)，C：曲线拐点，Y：OD将测得的供试品吸光度值带入该方程，得到每个供试品所对应的抗原含量，计算供试品中的抗原回收率。回收率(％)＝(疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于解吸附铝盐吸附型DTap‑IPV联合疫苗中D‑抗原的解吸附剂，其特征在于，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。

【技术特征摘要】
1.用于解吸附铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原的解吸附剂，其特征在于，其为含有至少一种表面活性剂的柠檬酸盐溶液。2.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述柠檬酸盐溶液为5％-30％的柠檬酸钠溶液。3.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选TritonX-100。4.根据权利要求1所述的解吸附剂，其特征在于，所述表面活性剂在柠檬酸盐溶液中的终浓度为0.05％-0.2％。5.根据权利要求1-4任一项所述的解吸附剂，其特征在于，其为含有TritonX-100的20％柠檬酸钠溶液，TritonX-100的终浓度为0.1％。6.用于测定铝盐吸附型DTap-IPV联合疫苗中D-抗原含量的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹珊珊，殷建齐，邓海清，任玉莹，王婷婷，张现臣，刘建凯，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11