水稻线粒体不育基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻育种技术领域，具体而言，涉及一种水稻线粒体不育基因及其应用。本发明专利技术公开了一种水稻线粒体不育基因及其编码序列，并通过该基因序列设计特异性分子标记可快速高效的从野生稻中筛选鉴定出D1型细胞质用做新D1型细胞质不育系的培育。它通过比较基因组学，鉴定出一个D1型细胞质不育系的线粒体基因组特异序列，基因预测及表达差异分析鉴定出不育相关ORFs，并构建植物转化载体转化保持系验证及不育功能。

【技术实现步骤摘要】
水稻线粒体不育基因及其应用
本专利技术涉及水稻育种
，具体而言，涉及一种水稻线粒体不育基因及其应用。
技术介绍
70年代我国应用三系法培育杂交水稻获得成功，并在生产上大面积推广种植，实现了我国水稻单产的第二次飞跃。1976-2005年，我国杂交水稻累计种植面积52.5亿亩，增收稻谷约6.5亿吨，因此杂交水稻的发展是提高粮食产量、解决粮食安全问题的重要途径(袁隆平，2008)。三系杂交水稻利用的基础是细胞质雄性不育，自从野败型细胞质雄性不育系被发现与大面积推广应用以来，上世纪70年代到80年代中期，育种家培育出多达60多种细胞质源来源于野败型、云南滇型(DianI和DianⅡ)、红莲型、冈型、K型和马协型等，尽管细胞质源和败育特点有较大差异，可分为孢子体不育和配子体不育两种类型(朱英国，2000)。其中，云南滇型、包台型和红莲型为配子体不育系，野败型、D型、K型和冈型等为孢子体败育类型，大部分的配子体败育恢保关系一致，而大部分孢子体败育类型的恢保关系一致，配子体败育和孢子体败育类型的恢保关系相反。在配子体细胞质雄性不育系中，已经克隆验证了包台型细胞质雄性不育基因orf79和红莲型细胞质雄性不育基因orfH79，两个不育基因为等位变异，有97％的序列同源性(Wangetal.2006；Pengetal.2010)，滇型不育系也鉴定到orf79等位变异基因。对于孢子体型细胞质雄性不育系，罗荡平等用全线粒体基因组表达分析的方法鉴定出野败型不育基因WA352，该基因由3个线粒体基因组片段和一个来源不明片段组成，其他孢子体细胞质不育类型，如印水型、矮败型、冈型、爪哇型、马协型、K型均含有不育基因WA352(Luoetal.2013)。目前，国际公认细胞质雄性不育类型主要为野败、红莲、包台三种类型，其中前面两种不育细胞质都来源于普通野生稻。20世纪70年代，国内外育种家还利用普通野生稻为细胞质供体培育了其他13种细胞质类型，如崖城野生稻细胞质、田东野生稻细胞质等(朱英国，2000)，因此，从野生稻中挖掘细胞质是培育新型细胞质雄性不育系的一个重要途径。东乡野生稻为多年生野生稻，是迄今为止发现的世界上分布最北的野生稻，被国内外誉为“野生植物大熊猫”(黄依南等，2012)，上世纪80年代，江西省农科院水稻所利用东乡野生稻作为细胞质供体培育出雄性不育系国际油粘A，但一直没有找到对该新型不育系育性恢复良好的恢复源，因此，没有得到推广和利用。近年来，江西省超级水稻研究发展中心以东乡野生稻为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，并以D1A为细胞质来源，分别与培矮64、天丰B、K17B、协青早B、II-32B、2454B、岳4B、9311等回交，获得一批新东野不育系，该类型不育系为孢子体不育系，分子标记鉴定该不育系不含有已克隆的孢子体不育基因WA352。无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，且保持谱广，绝大多数栽培品种可为其保持系。同时，在同质野生稻中找到恢复系，并实现同质野生稻恢复系恢复基因的栽培稻转育，最高恢复率达到85.1％。利用该含强恢复系品种，我们也在筛选优良恢复系并配制杂交组合。因此，它的败育特点、分子机理和恢保关系与目前推广的其他不育系完全不同，为一种新型孢子体不育类型，命名为D1型。该不育系的研究及应用推广作为一种互补类型极大地丰富杂交水稻类型，对促进杂交水稻的可持续发展具有重要价值。然而，D1细胞质不育基因至今还未得到克隆。克隆D1型不育基因对于了解无花粉型细胞质雄性不育败育机理，创建新型D1型细胞质雄性不育系和恢复系，培育D1型杂交水稻水稻品种，进一步利用水稻杂种优势，提高水稻产量具有重要作用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术公开了一种水稻线粒体不育基因及其编码序列，并通过该基因序列设计特异性分子标记可快速高效的从野生稻中筛选鉴定出D1型细胞质用做新D1型细胞质不育系的培育。它通过比较基因组学，鉴定出一个D1型细胞质不育系的线粒体基因组特异序列，基因预测及表达差异分析鉴定出不育相关ORFs，并构建植物转化载体转化保持系验证及不育功能。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种水稻线粒体不育基因，所述基因的序列选自下列组的序列之一：a)、具有SEQIDNO：1的核苷酸序列；b)、在严格条件下能够与a)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；c)、与a)或b)所述序列互补的核苷酸序列。近年来，江西省农科院以东乡野生稻为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，该类型不育系为孢子体不育系，无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，命名为D1型细胞质，分子标记鉴定该不育系不含有已克隆的孢子体不育基因WA352。申请人通过线粒体测序和比较基因组学，在该D1型不育系线粒体基因组中鉴定到一个D1型特异的开放阅读框，该开放阅读框编码182个氨基酸，其序列如SEQIDNO：1所示，能导致产生细胞质雄性败育。本领域技术人员应该知晓，本专利技术所述的水稻线粒体不育基因还包括与核苷酸序列SEQIDNO：1高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严格条件下能够与具有SEQIDNO：1所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本专利技术中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mMPIPES(pH6.4)和1mMEDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。功能等价体序列还包括与SEQIDNO：1所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性，且具有育性调控功能的基因序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。一种表达载体，其包含权利要求1所述的基因。优选的，所述表达载体为PCAMBIA1301载体。一种工程菌，其被如上所述的表达载体所转化。优选的，所述工程菌为农杆菌。本专利技术所提供的基因可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌，最优选的为农杆菌。在描述本专利技术的化合物、组合物、蛋白质、肽等以及方法之前，应当理解，这些实施方式不限于所描述的特定方法、方案以及试剂，这是因为它们可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式目的，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水稻线粒体不育基因，其特征在于，所述基因的序列选自下列组的序列之一：a)、具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；b)、在严格条件下能够与a)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；c)、与a)或b)所述序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种水稻线粒体不育基因，其特征在于，所述基因的序列选自下列组的序列之一：a)、具有SEQIDNO：1的核苷酸序列；b)、在严格条件下能够与a)所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；c)、与a)或b)所述序列互补的核苷酸序列。2.一种表达载体，其包含权利要求1所述的基因。3.一种工程菌，其被权利要求2所述的表达载体所转化。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为农杆菌。5.权利要求1所述的基因编码的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。7.一种引物对，其上...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡耀辉，谢红卫，彭晓珏，钱明娟，蔡怡聪，丁霞，朱友林，颜龙安，
申请(专利权)人：江西省超级水稻研究发展中心，南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36