低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个来源于桃的PpFAD3‑2基因，其核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD3‑2可以催化不饱和脂肪酸亚麻酸(18:3)合成。桃果实采后低温贮藏诱导了PpFAD3‑2表达，转至常温货架则显著降低该基因表达。在烟草中过量表达PpFAD3‑2显著增加了不饱和脂肪酸亚麻酸含量，提高了在低温条件下的存活率，具有重要的应用价值。体外构建的PpFAD3‑2重组蛋白在酿酒酵母中进行异源表达可催化亚麻酸生物合成，具有营养保健的应用潜力。 1

【技术实现步骤摘要】
低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体涉及一个可以提高低温抗性的PpFAD3-2基因。
技术介绍
低温贮藏是有效延长采后果实贮藏期的生产措施。然而对于桃等冷敏性的果实，较长时间的低温会造成生理代谢失调，导致冷害症状，从而丧失品质和商品性。为了减轻或者延缓桃果实采后低温贮藏导致的冷害，先后研发了基于温度、气体、化学处理等多种采后保鲜措施。通过基因工程手段增加低温抗性已经在拟南芥、水稻、番茄、杨树和柑橘等多种植物中实施，挖掘和鉴别桃果实低温应答基因开始展示出巨大的应用潜力。通常认为，较高的不饱和脂肪酸含量能有效降低生物膜的相变温度，维持膜的流动性，以适应低温环境，由此延缓或减轻果实冷害并维持良好品质。拟南芥等模式植物研究表明，FAD是脂肪酸去饱和酶，参与不饱和脂肪酸合成，在应答低温过程中具有重要作用。FAD包含多个基因家族成员，不同成员可能具有不同的功能。有关桃果实采后低温诱导表达的FAD基因有待进一步鉴别，相关的基因功能也有待阐明。桃基因组测序的完成，转录组测序技术普及以及基因功能验证技术的进步，使得鉴别低温诱导FAD并开展功能应用成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2，所述PpFAD3-2基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。该基因特征功能如下：基因表达特征：低温诱导PpFAD3-2表达。桃果实置于采后0℃低温贮藏，PpFAD3-2表达水平持续增加，从低温转至常温20℃货架则显著抑制基因表达。本专利技术的另一个目的是提供所述低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2在基因工程中的应用。所述应用是利用基因工程技术将PpFAD3-2_SK重组载体转化普通烟草，采用SEQ:NO.6和SEQ:NO.7列构建转基因载体，过量表达PpFAD3-2显著提高烟草植株在低温下的存活率，显著提高不饱和脂肪酸亚麻酸18:3含量。所述应用是利用引物对SEQ:NO.4和SEQ:NO.5构建重组蛋白，在酿酒酵母中异源表达催化亚麻酸合成。本专利技术提供一个来源于桃的PpFAD3-2基因，在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD3-2可以催化不饱和脂肪酸亚麻酸(18:3)合成。桃果实采后低温贮藏诱导了PpFAD3-2表达，转至常温货架则显著降低该基因表达。在烟草中过量表达PpFAD3-2显著增加了不饱和脂肪酸亚麻酸含量，提高了在低温条件下的存活率，具有重要的应用价值。体外构建的PpFAD3-2重组蛋白在酿酒酵母中进行异源表达可催化亚麻酸生物合成，具有营养保健的应用潜力。附图说明图1：桃果实采后低温处理诱导PpFAD3-2表达。图2：过量表达PpFAD3-2的显著增加烟草植株低温条件下的存活率。图3：过量表达PpFAD3-2显著增加转基因烟草的亚麻酸含量。图4：酿酒酵母异源表达PpFAD3-2编码蛋白催化亚麻酸合成。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步阐述，但实施例不限制本专利技术的保护范围。实施例1：PpFAD3-2基因的克隆(一)实验方法以拟南芥中AtFAD3为参考序列，应用blastp算法查找桃基因组数据库的同源序列，选取匹配度最高的序列，设计引物对SEQ:NO.2和SEQ:NO.3，以桃cDNA为模板，进行PCR扩增及测序分析，获得PpFAD3-2序列SEQ:NO.1。PCR反应体系为50μl，成分分别为：0.5μlTaq酶(Roche)，5μl缓冲液(10×)，4μldNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，Invitrogen)各2μl，4μlcDNA，32.5μlH2O。RT-qPCR反应程序为95℃反应5min；95℃反应30s，58℃反应30s，72℃延伸2min，37个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。(二)实验结果经测序验证，获得与桃果实基因组数据库相匹配的PpFAD3-2序列SEQ:NO.1。实施例2：温度处理对桃果实PpFAD3-2基因表达的影响(一)实验方法1.桃果实材料商业成熟的桃果实，选择大小均匀，成熟度一致，无明显病虫害或机械损伤的果实作为材料。初始点取样后，将果实随机分为3组进行贮藏：第一组果实一直置于0℃，第二组果实置于20℃，第三组果实是0℃贮藏72h后转移至20℃货架72h。每个取样点设置3个生物学重复，每个重复3个果实，共计9个果实。2.基因表达分析利用CTAB法提取桃果实总RNA，最后用去RNase的DEPC水溶解。总RNA纯度根据NanoPhotometerTMPearlUserManual测定，干冰运输至生物公司进行转录组测序，基因表达水平用RPKM值表示。(二)实验结果桃果实PpFAD3-2表达被低温诱导，从低温转至常温20℃货架显著抑制基因表达(图1)。实施例3：转基因烟草过量表达PpFAD3-2提高低温下植株的存活率(一)实验方法1.载体构建结合引物对SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，利用PCR技术扩增获得PpFAD3-2。PCR产物和目标载体(pGreen002962-SK)用限制性内切酶BglⅡ和EcoRI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证，将序列确认正确的质粒利用电击法转化农杆菌株系GV3101::pSoup。2.转基因植株鉴定经基因工程技术转化普通烟草获得转化植株后，需要进一步通过PCR和qPCR手段进行验证。利用CTAB法提取烟草叶片DNA，利用所得的DNA做模板，结合引物对SEQ:NO.10和SEQ:NO.11，用PCR进行转基因植株鉴定。取经过PCR鉴定的植株叶片，利用TRIzol(Invitrogen)提取烟草总RNA，用TURBODNaseKit(Ambion)试剂盒去除基因组DNA污染后，取1.0μgRNA按iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad)试剂说明书操作合成cDNA。RT-qPCR检测中，PpFAD3-2引物对为SEQ:NO8和SEQNO.9，以普通烟草EF1-α基因(SEQ:NO.12)作为内参基因，引物为SEQ:NO.13和SEQ:NO.14。qPCR反应体系包括10μlSsofastEvaGreenSupermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μl，2μlcDNA，6μlH2O。反应程序为95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，45个循环。所用仪器为Bio-RadCFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H2O作反应模板的阴性对照。3.植株的低温处理和存活率统计转基因和非转基因的烟草植株在-2℃低温处理10d，然后转移到20℃恢复10d，统计植株的存活率并拍照记录。(二)实验结果过量表达PpFAD3-2的转基因烟草植株，低温处理后的存活率约72％，显著高于非转基因对照植株的17.2％(图2)，表明在过量表达桃果实PpFAD3-2显著增强了植株的低温抗性。实施例4：转基因烟草过量表达PpFAD3-2增加亚麻酸含量(一)实验方法1.载体构建和转基因植株鉴定实验方法见实施例2。2.脂肪酸检测取0.2g充分研磨的烟草叶片转移至50ml离心管中，加入15ml正己烷：异丙醇(V:V＝3:2)溶液和7.5ml的0.67％Na2SO4(m:v＝0.67％)溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个低温诱导表达的桃基因PpFAD3‑2，其特征在于，所述PpFAD3‑2基因的核苷酸序

【技术特征摘要】
1.一个低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2，其特征在于，所述PpFAD3-2基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。2.权利要求1所述的一个低温诱导表达的PpFAD3-2在基因工程中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是采用SEQ:NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，高柳肖，王娇娇，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33