包括选择和富集步骤的染色体构象捕获方法技术

本发明专利技术涉及通过使用分离的核酸分子鉴定与靶核酸区段相互作用的核酸区段的方法，以及用于所述方法的试剂盒。本发明专利技术还涉及鉴定一种或多种指示特定疾病状态的相互作用核酸区段的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于鉴定与靶核酸区段相互作用的核酸区段的方法，特别是用于鉴定与靶核酸区段的子集相互作用的核酸区段的方法，以及用于进行该方法的试剂盒。本专利技术还涉及鉴定一种或多种指示特定疾病状态的相互作用核酸区段的方法。专利技术背景调控元件在生物体的遗传控制中发挥关键作用，并已被证明促成健康和疾病（例如癌症和自身免疫性疾病）。这些调控元件的鉴定也可以在分子生物学中具有潜在的应用，例如在表达系统和遗传修饰技术中。然而，虽然数以千计的调控元件已经在小鼠和人的基因组中作图，但是确定它们调节哪些目标基因代表一个重大的挑战。已经证明调控DNA序列（例如，增强子）可以跨过(bridge)相当的基因组距离以与它们的靶基因相互作用。基因及其调控区之间的染色体接触可以被捕获，但目前缺失在全基因组规模将基因连接到其调控序列的方法。开发以鉴定基因组基因座之间相互作用的最早的方法之一是染色体构象捕获（3C）技术（Dekker等Science(2002)295:1306-1311）。这涉及通过如下产生3C文库：交联核组合物，以便空间上紧密邻近的基因组基因座被连接；通过消化除去交联之间的插入DNA（interveningDNA）环；并且连接和逆转交联相互作用区域以生成3C文库。所述文库然后可以用于计算已知序列间相互作用频率。但是此方法需要先前的相互作用的知识，以便检测目标相互作用区域。从那之后，该技术已经进一步开发以尝试和克服3C法的限制。例如4C法使用反向PCR以鉴定其中特异性相互作用是未知的诱饵序列的相互作用（Simonis等Nat.Genet.(2006)38:1341-1347；和Zhao等Nat.Genet.(2006)38:1348-1354）。然而，该方法对时间和资源两者是昂贵的，设计用来检测与仅一个诱饵基因组基因座的相互作用，并且仅是半定量的。Hi-C方法使用连接标志物以分离细胞中所有的连接的相互作用序列（参见WO2010/036323和Lieberman-Aiden等,Science(2009)326:289-93）。虽然这提供了关于在特定时间点上核组合物内发生的所有相互作用的信息，但是每个细胞有约800,000个可连接的片段（例如，如果具有6个碱基对的识别位点的限制性内切酶，如HindⅢ或BglⅡ已被用于Hi-C文库的生成），这使得文库过于复杂且阻止特定个别区域之间的相互作用的问询。因此，需要提供克服了现有方法局限性的用于鉴定核酸相互作用的改进的方法。专利技术概述根据本专利技术的第一个方面，提供了用于鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段的方法，所述方法包括以下步骤：（a）获得包含靶核酸区段子集的核酸组合物；（b）交联核酸组合物；（c）通过超声处理片段化交联的核组合物；（d）连接从步骤（c）得到的片段化的核酸区段以产生连接的片段；（e）添加结合靶核酸区段子集的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子用结合对的第一半标记；（f）通过使用所述结合对的第二半分离连接的片段，其包含结合到分离的核酸分子的靶核酸区段的子集；和（g）测序来自步骤（f）的分离的连接的片段以鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段。根据本专利技术的进一步的方面，提供了鉴定一种或多种指示特定疾病状态的相互作用核酸区段的方法，其包括：a）对从具有特定疾病状态的个体获得的核酸组合物执行本文定义的方法；b）定量核酸区段和靶核酸区段之间的相互作用频率；c）比较来自具有所述疾病状态的个体的核酸组合物中相互作用频率与来自健康主体的正常对照核酸组合物中相互作用频率，使得核酸组合物中相互作用频率的差异指示特定疾病状态。根据本专利技术进一步的方面，提供了用于鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段的试剂盒，其包含能够进行本文所限定的方法的缓冲液和试剂。附图简述图1：本文描述的专利技术的实施方案的示意图概述。图2：使用本文所述方法获得的结果。图2（A）展示了MYC基因周围的基因组区域和MYC基因在CD34+细胞中的染色体相互作用概况。图2（B）显示了CD34+细胞核的DNAFISH的实例。图2（C）显示使用3C方法对MYC启动子和在所述基因下游1.8Mb处区域的相互作用的验证。专利技术详述根据本专利技术的第一个方面，提供了用于鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段的方法，所述方法包括以下步骤：（a）获得包含靶核酸区段子集的核酸组合物；（b）交联核酸组合物；（c）通过超声处理片段化交联的核酸组合物；（d）连接从步骤（c）得到的片段化的核酸区段以产生连接的片段；（e）添加结合靶核酸区段子集的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子用结合对的第一半标记；（f）通过使用所述结合对的第二半分离连接的片段，其包含结合到分离的核酸分子的靶核酸区段的子集；和（g）测序来自步骤（f）的分离的连接的片段以鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段。根据可以提及的本专利技术的第二方面，提供了用于鉴定与靶核酸区段相互作用的核酸区段的方法，所述方法包括以下步骤：（a）获得包含靶核酸区段的核酸组合物；（b）交联核酸组合物；（c）片段化交联的核组合物；（d）连接从步骤（c）得到的片段化的核酸区段以产生连接的片段；（e）添加配置以结合靶核酸区段的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子用结合对的第一半标记；（f）通过使用所述结合对的第二半分离连接的片段，其包含结合到分离的核酸分子的靶核酸区段；和（g）测序来自步骤（f）的分离的连接的片段以鉴定与靶核酸区段相互作用的核酸区段。本专利技术的方法提供了通过使用分离的核酸分子分离靶核酸区段用于鉴定相互作用序列的手段，特别是分离靶核酸区段子集的分离的核酸分子。这有助于在非常复杂的文库内将数据集中在特定的相互作用，并可以用于组织信息成各种子集，其取决于所用的分离的核酸分子的类型（例如启动子，以鉴定启动子相互作用）。然后可以获得在特定子集内的染色体相互作用的详细信息。尽管以前的技术，诸如4C，允许一个或几个启动子的全基因组相互作用的捕获，但本文描述的方法可以在一个单一实验中捕获超过22,000个启动子以及它们的相互作用基因组基因座。此外，本方法产生了显著更定量的读出。全基因组关联研究（GWAS）已经鉴定了数千个与疾病有联系的单核苷酸多态性（SNP）。然而，许多这些SNP位置距离基因很远，使得预测它们对其作用的基因非常具有挑战性。因此，本方法提供了鉴定相互作用核酸区段的一种方式，即使它们在基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段的方法，所述方法包括以下步骤：（a）获得包含靶核酸区段子集的核酸组合物；（b）交联所述核酸组合物；（c）通过超声处理片段化交联的核酸组合物；（d）连接从步骤（c）得到的片段化的核酸区段以产生连接的片段；（e）添加结合靶核酸区段子集的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子用结合对的第一半标记；（f）通过使用所述结合对的第二半分离连接的片段，其包含结合到分离的核酸分子的靶核酸区段的子集；和（g）测序来自步骤（f）的分离的连接的片段以鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.05 GB 1315777.11.用于鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸区段的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）获得包含靶核酸区段子集的核酸组合物；
（b）交联所述核酸组合物；
（c）通过超声处理片段化交联的核酸组合物；
（d）连接从步骤（c）得到的片段化的核酸区段以产生连接的片段；
（e）添加结合靶核酸区段子集的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子用结合对
的第一半标记；
（f）通过使用所述结合对的第二半分离连接的片段，其包含结合到分离的核酸分子的
靶核酸区段的子集；和
（g）测序来自步骤（f）的分离的连接的片段以鉴定与靶核酸区段子集相互作用的核酸
区段。
2.权利要求1的方法，其中靶核酸分子的子集选自启动子、沉默基因、增强子或绝缘子，
诸如启动子。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述分离的核酸分子从细菌人工染色体（BAC）、
F黏粒或粘粒获得。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述分离的核酸分子是RNA。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述结合对的第一半包含生物素并且所述结合对
的第二半包含链霉亲和素。
6.权利要求1-5任一项的方法，其额外包括在步骤（d）期间向连接的片段中并入连接标
志物。
7.权利要求6的方法，其中所述连接标志物包括生物素。
8.权利要求1-7任一项的方法，其额外包...

【专利技术属性】
技术研发人员：P弗拉泽，C奥斯本，S舍恩费尔德，
申请(专利权)人：巴布拉哈姆研究院，
类型：发明
国别省市：英国;GB