一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷具有荧光特性的金纳米簇作为荧光探针，利用所述荧光探针分别与肝素钠标准品溶液和含有多硫酸软骨素类杂质的肝素钠溶液混合后，具有不同的荧光增强效果这一特性，对肝素钠产品中的多硫酸软骨素杂质进行检测和测定。提供一种高效快速检测肝素钠中是否含有多硫酸软骨素的方法。本方法具有成本低、灵敏度高、快速高效、操作性强等优点，可以实现肝素钠中是否含有多硫酸软骨素杂质的快速的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法
本专利技术属于功能性纳米材料技术应用领域，涉及一种以金纳米簇为荧光指示剂检测肝素钠中多硫酸软骨素杂质的方法，具体涉及利用一种采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷可以产生荧光的金纳米簇作为荧光探针，利用此探针分别与肝素钠溶液和多硫酸软骨素溶液混合后，具有显著不同的荧光增强效果这一特性，利用金纳米簇的荧光变化程度，对肝素钠产品中含有的多硫酸软骨素杂质进行检测。
技术介绍
肝素钠(Heparinsodium)是一种常见的血液抗凝剂，它是由带有负电荷的二糖单元连接而成的聚合物，是一种硫酸氨基聚糖的钠盐，主要是从健康猪小肠粘膜中提取的精制的一种粘多糖类药物，被广泛应用于治疗静脉血栓和预防凝血等医疗领域。2008年，中国出口到美国的肝素原料药和最终成品出现质量问题，导致多名病患出现了过敏反应和其他的副作用，对病患的身体健康和医院的正常的医护造成了不良影响。经过有关部门的调查，这次事件的原因是肝素钠中掺杂有结构类似的多糖类杂质多硫酸软骨素(Over-sulfatedchondroitinsulfate,OSCS)。由于包括硫酸软骨素在内的多种杂质多糖分子的结构、分子量、电荷密度、抗凝活性与肝素钠十分的相似，这对糖类杂质的鉴定与检测造成了一定的难度。因此，如何快速准确的鉴定出肝素钠中所含有的多硫酸软骨素类多糖杂质，是提高该药品检测水平的关键，也是提高药品安全性和病患人身安全的关键。相关的检测方法和规定也上升至中国药典和美国药典质量标准。目前，对于肝素钠的鉴定主要有毛细管电泳(CE)、核磁共振(NMR)、以及色谱法等方式。毛细管方法可以测试肝素钠中是否含有多硫酸软骨素，但是由于该方法图谱主成分峰和多硫酸软骨素尖峰不能完全的分离，有可能会造成误判。据国外文献报道核磁共振氢谱(1H-nuclearmagneticresonance，1H-NMR)从OSCS污染的肝素中可以检测到异于肝素的N-乙酰基甲基峰，通过检测这一特征峰可以判断肝素中是否含有OSCS污染物。另外，国外的研究团队对强阴离子交换高效液相色谱(stronganionexchange-highperformanceliquidchromatography，SAX-HPLC)检测肝素中OSCS含量的方法进行了相关的研究。但是这些方法都对仪器要求较高，成本昂贵，因此开发出一种简单准确高效的区分肝素钠和其他糖类杂质的方法具有迫切的市场需求及良好的社会效益。金属纳米簇是介于金属原子和纳米粒子之间的一类新型材料，具有较强的荧光发射、良好的稳定性以及较好的生物相溶性等优点，可应用于生物小分子检测领域。如中国专利技术专利CN104865235B公开了一种基于原位制备的荧光银纳米簇检测葡萄糖浓度的方法，采用制备的荧光银纳米簇荧光发射轻度与葡萄糖浓度建立定量关系，从而实现葡萄糖浓度的检测。中国专利技术专利CN104330393B公开了以金纳米簇为荧光探针的葡萄糖检测方法。上述两种方法都是采用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2,Fe2+催化H2O2产生自由基使金纳米簇的荧光发生淬灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，这些检测方法只是针对单一的糖类进行检测，不能对结构相似的不易区分的两种多聚糖进行区分，针对这一难题，我们设计能够实现对肝素钠、多硫酸软骨素进行不同荧光响应的金纳米簇来实现对肝素钠中的含有的杂质多硫酸软骨素进行定性与定量的检测，该方法具有简单、方便快捷等优点。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的不足，寻求一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质以及测定肝素钠纯度的方法。解决现有肝素钠中多硫酸软骨素类杂质检测方法成本高、方法复杂的问题。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷具有荧光特性的金纳米簇作为荧光探针，利用所述荧光探针分别与肝素钠标准品溶液和含有多硫酸软骨素类杂质的肝素钠溶液混合后，具有不同的荧光增强效果这一特性，对肝素钠产品中的多硫酸软骨素杂质进行检测和测定。一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，具体包括以下步骤：(1)将一定量的金纳米簇分别加入到肝素钠标准品溶液和待测肝素钠溶液中，混合均匀后静置,其中金纳米簇与肝素钠标准品的质量比为(3～4):1；(2)、在波长为400nm的激发光下，使用荧光分光光度计测量步骤(1)所得到两种溶液在420nm-780nm波段的荧光发射光谱，同时对比600nm波长处的两种溶液的荧光强度，若荧光强度相同，则待测肝素钠溶液中不含杂质，反之，待测肝素钠溶液中含有杂质；(3)、向不同比例掺杂的多硫酸软骨素标准品和肝素钠标准品混合溶液中加入一定量的金纳米簇，混合均匀后静置；(4)、在波长为400nm的激发光下，使用荧光分光光度计测量步骤(3)所得到溶液在420nm-780nm波段的荧光发射光谱，取600nm处的荧光强度值，作多硫酸软骨素浓度与荧光响应性的标准曲线图，根据标准曲线图和步骤(2)中待测肝素钠所测得荧光强度，计算待测肝素钠中多硫酸软骨素的含量。所述步骤(1)中所用肝素钠标准品溶液浓度、待测肝素钠溶液浓度以及步骤(3)中肝素钠标准品和多硫酸软骨素标准品混合溶液的总浓度相同，所述步骤(1)和步骤(3)中金纳米簇添加量相同。进一步地，所述步骤(1)溶液中金纳米簇的浓度为100-200μg/mL，优选为150μg/mL。进一步地，所述金纳米簇采用专利ZL201610389189.7，一种以多肽为还原剂和稳定剂制备金纳米簇的制备方法中所述方法制备。与现有技术相比，本专利技术以简便易得的金纳米簇为荧光检测试剂，利用肝素钠以及肝素钠中多硫酸软骨素分子的电荷密度不同，对金纳米簇荧光产生不同的荧光增强效果原理，建立金纳米簇的荧光变化与肝素钠中成分变化的联系，提供一种高效快速检测肝素钠中是否含有多硫酸软骨素的方法。本方法具有成本低、灵敏度高、快速高效、操作性强等优点，可以实现肝素钠中是否含有多硫酸软骨素杂质的快速的检测。附图说明：图1为本专利技术实施例1中不同溶液与等量金纳米簇混合后的荧光发射光谱图。图2为本专利技术实施例2中待测肝素钠溶液与等量金纳米簇混合后的荧光发射光谱图。图3为本专利技术实施例2中不同比例掺杂的多硫酸软骨素标准品和肝素钠标准品混合溶液与等量金纳米簇混合后的荧光发射光谱图。图4为本专利技术实施例2中以不同多硫酸软骨素浓度为横坐标，不同比例掺杂的多硫酸软骨素标准品和肝素钠标准品混合溶液荧光强度相对不含多硫酸软骨素的肝素钠标准品溶液荧光强度变化值为纵坐标的多硫酸软骨素杂质含量标准工作曲线。具体实施方式下面通过具体实施方式和附图对本专利技术做进一步说明。以下实施例中所使用的荧光分光光度计为日本日立公司生产的F-2500荧光分光光度计。实施例1：(1)金纳米簇的制备用超纯水配置HAuCl4(20mmol/L)、KRKC(20mmol/L)和GSH(20mmol/L)的溶液，将玻璃瓶使用王水浸泡处理，清晰干净后烘干备用；向处理好的玻璃瓶中加入400μL的KRKC溶液及120μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液280μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，其特征在于，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷具有荧光特性的金纳米簇作为荧光探针，利用所述荧光探针分别与肝素钠标准品溶液和含有多硫酸软骨素类杂质的肝素钠溶液混合后，具有不同的荧光增强效果这一特性，对肝素钠产品中的多硫酸软骨素杂质进行检测和测定。

【技术特征摘要】
1.一种检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，其特征在于，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂合成表面带有正电荷具有荧光特性的金纳米簇作为荧光探针，利用所述荧光探针分别与肝素钠标准品溶液和含有多硫酸软骨素类杂质的肝素钠溶液混合后，具有不同的荧光增强效果这一特性，对肝素钠产品中的多硫酸软骨素杂质进行检测和测定。2.根据权利要求1所述的检测肝素钠中多硫酸软骨素类杂质的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)、将一定量的金纳米簇分别加入到肝素钠标准品溶液和待测肝素钠溶液中，混合均匀后静置,其中金纳米簇与肝素钠标准品的质量比为(3～4):1；(2)、在波长为400nm的激发光下，使用荧光分光光度计测量步骤(1)所得到两种溶液在420nm-780nm波段的荧光发射光谱，同时对比600nm波长处的两种溶液的荧光强度，若荧光强度相同，则待测肝素钠溶液中不含杂质，反之，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓娟，马锡琦，黄方，葛保胜，夏永清，孙怡鑫，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37