一种筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种可快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，包括：使用浓度为130μg/mL的N‑环己基‑N′‑(2‑吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐水溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL，再在其中掺入20μg/mL的纳米石墨烯作为增敏剂；然后包被96孔细胞培养板备用；将人皮肤鳞癌细胞系A431接种于包被处理后的96孔细胞培养板上；12h后更换含受试化学物的培养基，进行常规细胞增殖试验和阳性对比检测，即可筛选出人组成型雄烷受体间接激活剂。该方法简单、快速、成本低，可以用于工业原料化学品、小分子化学药、农药等化学物是否人组成型雄烷受体间接激活剂的快速筛选，有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法
本专利技术涉及一种筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，尤其是以纳米石墨烯增敏剂快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，属于生物化学领域。
技术介绍
组成型雄烷受体(ConstitutiveAndrostaneReceptor,CAR)是属于核受体超家族的一种受体蛋白，按核受体系统命名为NR1I3，是机体对环境外源性化学物的感受器。人组成型雄烷受体(hCAR)基因鉴定于1994年，其后不久，由于发现CAR在细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)2B诱导表达中起关键作用，受到研究者的重视。CAR在各器官广泛表达，尤其在肝脏、肠组织中高表达。目前已知的CAR生物效应包括：调节代谢酶和转运蛋白基因表达水平；能量代谢调节；内源代谢物及内分泌激素表达水平调节；化学致癌作用等。基于上述重要作用，2007年美国国家研究委员会(NRC)发表的《二十一世纪毒性测试：策略及展望》中，CAR活化作用被列为体外测试毒性途径之一。在药物研发、化学品毒性检测中，需要对化学物是否为CAR激活剂进行筛选。CAR激活剂分为直接激活剂和间接激活剂。目前已知的一种间接激活途径是通过表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)抑制作用，EGFR抑制作用的筛选主要应用EGF依赖性细胞增殖试验，需要在培养液中添加EGF。因此，建立一种快速、低成本筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法具有应用前景。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种操作简单、成本低的细胞试验方法筛选人组成型雄烷受体间接激活剂。为实现上述目的，本专利技术应用一种纳米石墨烯作为细胞试验增敏剂，建立一种可快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，该方法包括如下步骤:1)使用浓度为130μg/mL的N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐(N-Cyclohexyl-N′-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate)水溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL；2)向配制好的鼠尾胶原溶液中掺入20μg/mL的纳米石墨烯作为增敏剂，然后加入96孔细胞培养板中，37℃，5％二氧化碳浓度中放置3～4h，使用灭菌水和磷酸盐缓冲液漂洗，备用；3)将人皮肤鳞癌细胞系A431接种于包被的96孔细胞培养板上；12h后更换含受试化学物的培养基，进行常规细胞增殖试验和阳性对比检测。本专利技术的有益效果在于：纳米石墨烯掺入鼠尾胶原溶液包被细胞培养板，将人皮肤鳞癌细胞系A431接种于包被的培养板上，纳米石墨烯作为增敏剂，具有激活EGFR的功能，因此所述包被液能够替代现有筛选方法中EGF的使用，不必在培养基中添加EGF，而是采用常规细胞增殖试验，即可筛选出人组成型雄烷受体间接激活剂。该方法简单、快速，成本低。所以，可以用于工业原料化学品、小分子化学药、农药等化学物是否人组成型雄烷受体间接激活剂的快速筛选，有广泛的应用前景。本专利技术还提供一种可以用于快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的细胞培养板包被液，它含有20μg/mL的纳米石墨烯、100μg/mL的I型鼠尾胶原和130μg/mL的N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐。本专利技术优选的包被液中，所述的纳米石墨烯为直径为20～30纳米的石墨烯。本专利技术所述的包被液通过如下方法制备：使用浓度为130μg/mL的N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐水溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL；然后在其中掺入20μg/mL的纳米石墨烯，即得到本专利技术所述的包被液。本专利技术的包被液可以应用于对人组成型雄烷受体间接激活剂的筛选中，其所含纳米石墨烯成分作为增敏剂，具有激活EGFR的功能，因此本专利技术的包被液能够替代现有筛选方法中EGF的使用，用于更加简便、快速、低成本地筛选出人组成型雄烷受体间接激活剂。附图说明图1为实施例中试验组方法条件下受试化学物对细胞增殖的抑制作用。图2为实施例中对比组I的不使用纳米石墨烯包被、添加EGF条件下受试化学物对细胞增殖的抑制作用。图3为实施例中对比组II的不使用纳米石墨烯包被、不添加EGF条件下受试化学物对细胞增殖的抑制作用。具体实施方式下面通过实施例结合附图进一步说明本专利技术。本专利技术建立了基于纳米石墨烯增敏的人组成型雄烷受体间接激活剂筛选细胞试验方法，本专利技术以对比培养基添加EGF试验结果为依据。所用的细胞增殖试验为常规方法，因此本专利技术未对细胞增殖试验参数进行探讨。实施例8种受试化学物是否为人组成型雄烷受体间接激活剂的筛选：①将每种受试物配制成为10mmol/L浓度的储备液；②配制130μg/mLN-环己基-N′-(2-吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐水溶液(2-8℃保存6个月)；③用上述②配制的溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL；④向③配制好的鼠尾胶原溶液中掺入20μg/mL直径为20～30纳米的石墨烯，得到试验组包被液；⑤将④所得试验组包被液以每孔0.15mL加入至96孔细胞培养板中，37℃5％二氧化碳环境中放置3～4h。以灭菌水和磷酸盐缓冲液漂洗，备用。包被后2个月内使用；⑥人皮肤鳞癌细胞系A431按每孔1.0×104个接种于经⑤包被的96孔细胞培养板上；⑦12h后配制含终浓度0.01μmol/L-100μmol/L受试物的完全培养基；每种受试物每个浓度3个平行孔处理。⑧对比组I：使用不包被培养板，在⑦配制的完全培养基中添加EGF(100μg/mL)进行上述⑥、⑦两步的接种和培养操作；对比组II：使用不包被培养板，在⑦配制的完全培养基中直接进行上述⑥、⑦两步的接种和培养操作；⑨24h后进行细胞增殖检测(Promega公司CellTiter细胞增殖检测试剂盒)；⑩常规方法计算半数抑制浓度(IC50)。结果(参见图1、2、3)，试验组：阳性对照物依法韦仑(EFV)IC50为13.78μmol/L，受试物吉非替尼(GFB)IC50为9.561μmol/L，三氯生(TCS)IC50为18.66μmol/L，为人组成型雄烷受体间接激活剂，邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二丁酯、三氯乙烯、三氯乙酸、全氟辛酸无细胞增殖抑制效应。对比组I：阳性对照物EFVIC50为14.39μmol/L，受试物GFBIC50为12.45μmol/L，TCSIC50为12.49μmol/L，为人组成型雄烷受体间接激活剂，邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二丁酯、三氯乙烯、三氯乙酸、全氟辛酸无细胞增殖抑制效应。对比组II：受试物在本试验条件下未见明显的细胞增殖抑制效应。实施例中不使用增敏剂、不添加EGF的细胞增殖试验，不能筛选出人组成型雄烷受体间接激活剂。不使用增敏剂、添加EGF的细胞增殖试验，与使用本专利技术建立的纳米石墨烯的鼠尾胶原溶液包被培养板、应用常规细胞增殖试验、不添加EGF的方法，筛选出人组成型雄烷受体间接激活剂的效果相当。本实施例中用到化学物有：依法韦仑、吉非替尼、三氯生、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二丁酯、三氯乙烯、三氯乙酸、全氟辛酸。以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，包括如下步骤：1)使用浓度为130μg/mL的N‑环己基‑N′‑(2‑吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐(N‑Cyclohexyl‑N′‑(2‑morpholinoethyl)carbodiimide metho‑p‑toluenesulfonate)水溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL；2)向步骤1)配制好的鼠尾胶原溶液中掺入20μg/mL的纳米石墨烯作为增敏剂，然后加入96孔细胞培养板中，37℃，5％二氧化碳浓度中放置3～4h，完成细胞培养板的包被；再使用灭菌水和磷酸盐缓冲液漂洗，备用；3)将人皮肤鳞癌细胞系A431接种于步骤2)包被处理后的96孔细胞培养板上；12h后更换含受试化学物的培养基，进行常规细胞增殖试验和阳性对比检测。

【技术特征摘要】
1.一种可快速筛选人组成型雄烷受体间接激活剂的方法，包括如下步骤：1)使用浓度为130μg/mL的N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)氨基氰甲代对甲苯磺酸盐(N-Cyclohexyl-N′-(2-morpholinoethyl)carbodiimidemetho-p-toluenesulfonate)水溶液稀释I型鼠尾胶原至100μg/mL；2)向步骤1)配制好的鼠尾胶原溶液中掺入20μg/mL的纳米石墨烯作为增敏剂，然后加入96孔细胞培养板中，37℃，5％二氧化碳浓度中放置3～4h，完成细胞培养板的包被；再使用灭菌水和磷酸盐缓冲液漂洗，备用；3)将人皮肤鳞癌细胞系A431接种于步骤2)包被处理后的96孔细胞培养板上；12h后更换含受试化学物的培养基，进行常规细胞增殖试...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海山，艾文超，韩辉，沈国林，崔媛，谢文平，魏长垒，赵永雷，钟贞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院国家食品安全危害分析与关键控制点应用研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11