一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。本方法快速简便，特异性强，灵敏度高，可重复性高，该方法在39℃下恒温扩增仅需10分钟，胶体金试纸条检测结果5分钟以内，检测结果肉眼观察，整个反应过程不需要昂贵实验仪器，只需一个恒温仪器，可以应用于偏远、资源贫乏地区和现场检测。该方法有望成为简易的常规检测手段，对保证食品安全有重要意义。

A recombinant enzyme polymerase isothermal amplification combined with test strip to detect single Lester bacteria and its application

The invention discloses a method for the detection of mono Lester bacteria by recombinant enzyme polymerase isothermal amplification and test paper. The following steps are as follows: the hlyA gene is selected as the detection target gene, and the specific primer pairs for the single increasing Lester bacteria are designed. The specific isothermal amplification is carried out with the genomic DNA of monzomycete, and the specific isothermal amplification is carried out. The test results were obtained with colloidal gold paper strip. This method is fast, simple, high specificity, high sensitivity and high repeatability. The method is only 10 minutes at constant temperature at 39 C, and the result of detection by colloidal gold paper strip is less than 5 minutes. The test results are observed by naked eye. The whole reaction process does not need expensive experimental instruments. Only one constant temperature instrument is needed, which can be applied to remote and resources. Poor areas and field testing. This method is expected to become a simple routine detection method, and is of great significance for ensuring food safety.

【技术实现步骤摘要】
一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用
本专利技术属于微生物检测
，涉及针对单增李斯特菌的恒温扩增快速检测技术，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用。
技术介绍
单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)广泛存在于自然界中，易污染肉类、奶类、海产品和蔬菜等，由于其易形成生物被膜，使它在食品中存活更长的时间。世界卫生组织在有关食物中毒报告中指出4％一8％的海产品、5％一10％的奶及制品和30％以上的肉制品存在单增李斯特菌污染。而且，由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖，使潜在的危害性进一步增大。食用被单增李斯特菌污染的食物除了会出现恶心、败血、腹泻等一般细菌性食物中毒症状外，还会导致心肌炎、脑膜炎、肠胃炎和肺炎等。在1986年WHO和FDA设立了李斯特菌研究中心，专门协调该菌的病原学、流行学及临床等研究工作，该菌已被列为90年代四大食品致病菌之一。在欧美、日本由单增李斯特菌造成的临床疾病和食物污染问题，在细菌性食物中毒中占第一位。因此现在世界各国都把单增李斯特菌列为食品卫生的法定检测项目。目前单增李斯特菌的检测方法主要包括细菌分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。细菌分离鉴定工作量大，成本较低，但检测周期长，灵敏度低；免疫学方法易交叉污染，假阳性严重，灵敏度偏低；分子生物学方法应用最广泛的是PCR，但操作繁琐耗时，必须依赖昂贵的实验设备，不便于在基层或现场检测进行推广。近年来，重组酶聚合酶(RPA)方法受到关注，该方法是一种新型核酸扩增技术，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，自2006年问世后，已应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。可在恒温条件下(37℃～42℃)实现对核酸的快速、特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，被认为是最接近所谓的“等温扩增”，具有广阔的应用前景。胶体金试纸条(LF)最大的特点是快捷迅速、灵敏准确、安全简便、成本低廉且不需要专业人员和仪器设备，通常几分钟内就可用肉眼观察到的检测结果。通过检索，尚未发现与本专利技术申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法和应用，该方法具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，步骤如下：选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。而且，所述引物对为：正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。而且，所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin标记。而且，所述胶体金试纸条包括背板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处(部分)重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。而且，所述背板为带有不干胶的衬垫。而且，所述金标垫的制备步骤如下：⑴制备胶体金根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继续加热15min；溶液冷却至室温，用超纯水恢复至原始体积，得胶体金，4℃避光保存；⑵胶体金标记抗体取1mL步骤⑴的胶体金，加入18μL0.2mol/LK2CO3调节胶体金至pH＝8.5，取10μL抗地高辛抗体加到胶体金溶液中，迅速震荡5min，混匀后的溶液于4℃静置1h，滴加混合后溶液总体积2％的质量浓度为20％的BSA溶液，混合后溶液总体积1％的质量浓度为20％的PEG20000溶液，混匀后，得混合后溶液，混合后溶液于4℃静置30min，然后2000rpm，4℃，离心15min，取上清液至干净的离心管中，10000r/min，4℃，离心30min，弃除上清液，胶体金颗粒沉淀用5倍体积的金标复溶液复溶，将溶液以30μL/cm喷涂在金标垫原板上，真空干燥过夜，即得带有胶体金标记抗体的金标垫。而且，具体步骤如下：⑴RPA反应体系：10μM正向引物和反向引物各2.4μL，1×rehydrationbuffer29.5μL，5ng样品模板DNA2.5μL，双蒸水10.7μL，重组酶聚合酶，280mmol乙酸镁，2.5μL，反应总体积50μL；⑵RPA反应体系扩增：向无菌离心管中依次加入rehydrationbuffer、双蒸水、正向引物、反向引物、模板DNA和重组酶聚合酶，充分振荡混匀，最后加入280mmol/μL乙酸镁，充分混合，简短离心，39℃水浴锅反应10min，取出反应管，得扩增产物；⑶试纸条检测：取100μL扩增产物到900μLPBST中混合，然后将混合液滴加到试纸条上，室温下静置5min，通过试纸条显色情况判断扩增结果；当试纸条检测线、质控线都有条带出现，说明结果阳性，存在单增李斯特菌；若只有质控线有条带，检测线位置无条带则说明结果阴性，不存在单增李斯特菌；若质控线未出现条带，结果无效。一种如上所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法在单增李斯特菌的检测中的应用。本专利技术取得的优点和积极效果是：1、本方法快速简便，特异性强，灵敏度高，可重复性高，该方法在39℃下恒温扩增仅需10分钟，胶体金试纸条检测结果5分钟以内，检测结果肉眼观察，整个反应过程不需要昂贵实验仪器，只需一个恒温仪器，可以应用于偏远、资源贫乏地区和现场检测。该方法有望成为简易的常规检测手段，对保证食品安全有重要意义。2、本专利技术提供的基于分子生物学的快速检测单增李斯特菌的方法，可以实现对单增李斯特菌进行快速，灵敏，简便的快速检测，该方法能够在检验检疫方面、食品工业部及卫生安全部有广阔的应用前景。3、本专利技术方法简便，快速，在20min内即可完成检测，结果可用肉眼观察；整个扩增过程只需39℃恒温，不需要复杂的仪器，使用范围广泛。附图说明图1为本专利技术中胶体金试纸条的检测试纸条工作原理、组装方法及结构连接示意图；图2为本专利技术方法优化温度与时间的结果图；其中，图a中的1-8分别依次表示25℃，30℃，35℃，37℃，39℃，42℃，45℃和阴性对照，图b中的1-6分别依次表示5min，10min，15min，20min，25min和阴性对照；图3为本专利技术方法优化羊抗鼠二抗和链霉亲和素浓度图；其中，图a中1-4分别依次表示0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：步骤如下：选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：步骤如下：选取hlyA基因作为检测靶基因，设计对单增李斯特菌具有特异性的引物对，以单增李斯特菌基因组DNA为模板，进行特异性恒温扩增，并应用胶体金试纸条获得检测结果。2.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述引物对为：正向引物的核苷酸序列SEQ1：GTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG；反向引物的核苷酸序列SEQ2：ACTCCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGTAGCA。3.根据权利要求2所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述正向引物的5’端用地高辛digoxin标记，所述反向引物的5’端用生物素biotin标记。4.根据权利要求1所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述胶体金试纸条包括背板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述背板沿水平方向设置，该背板上由左至右依次相连接设置样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置羊抗鼠抗体。5.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述背板为带有不干胶的衬垫。6.根据权利要求4所述的重组酶聚合酶恒温扩增结合试纸条检测单增李斯特菌的方法，其特征在于：所述金标垫的制备步骤如下：⑴制备胶体金根据柠檬酸钠还原法制备胶体金方法制备20nm的胶体金，方法如下：将含转子的锥形瓶中加入100mL超纯水，加热煮沸后保持3min后弃除水分；取99mL超纯水和1mL质量浓度为1％的已过滤的氯金酸加至锥形瓶，加热至沸腾煮沸后加入2.25mL质量浓度为1％的柠檬酸三钠不断搅拌，溶液变至酒红色，颜色保持稳定不再变化时，再继...

【专利技术属性】
技术研发人员：任士常，张志红，
申请(专利权)人：中科智测天津科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12