用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及方法技术

本发明专利技术提供用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物对和探针，引物对为：上游引物：5’‑TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC‑3’，下游引物：5’‑CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC‑3’；其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T；探针为：5’‑CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT‑Fam]G[THF]C‑[dT‑BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3 spacer]‑3’。本发明专利技术具有以下优点：只需要在39‑40℃下恒温反应即可，不需要额外的设备；反应时间仅需20min；结果易于判断；特异性好，灵敏度高。

RPA primers, probes and methods for detection of pork ingredients in meat products

The present invention provides a RPA primer pair and a probe for detecting pork components in meat products. Primers are: upstream primers: 5 'TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC 3', downstream primers: 5 'Y CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC 3'; among them, the primers are degenerate base, Y is C or T; the probe is 5 'CTAGTTAAAA CTAGTTAAAA TAAAATAACCCACGAAAG[dT Fam]G[THF]C [dT BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3 BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3 spacer] 3. The invention has the following advantages: only a constant temperature reaction is needed at 39 40 degrees C, no additional equipment is needed; the reaction time is only 20min; the result is easy to judge; the specificity is good and the sensitivity is high.

【技术实现步骤摘要】
用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及方法
本专利技术涉及用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物及方法，特别是肉食加工为主的食品。本方法尤其适用于鉴定清真食品认证的加工食品中是否存在猪肉(Susscrofa)成分。
技术介绍
食品掺假，尤其是肉类掺假已经成为一个国际性问题，中国也很早就有“挂羊头卖狗肉”的说法。肉类掺假不仅是一个经济问题，还可能损害消费者健康甚至带来一系列宗教问题。因此，建立快速高效的检测技术是打击肉品掺假犯罪和市场监督执法的共同需求。肉类食品营养价值高，是人们日常食物消费的重要组成部分，由于价格昂贵，成为食品掺假的重要对象。以廉价肉品代替或混入价格较高的肉品中进行的肉类掺假，尤其以猪肉替代牛、羊肉的现象时有发生。随着现代食品工业的快速发展和食品种类的多样化，掺假对象也从原来的冷鲜肉和简单加工肉品渗入到多个种类的产品，尤其是现代深加工肉品，掺假手段更加隐蔽，难以通过食品的外观判断其成分。为了打击这些食品掺假犯罪，维护消费者权益，监管部门和研究人员对掺假鉴定技术也在不断发展和完善。早期肉类的鉴别主要依赖于感官和形态学检验，但这些检验方法受仪器、人员经验和肉类处理过程等诸多因素的影响，且局限性大、准确性低，对于深加工肉类中添加的动物源性成分难以鉴别。随着分子生物学的发展，基于DNA分析的PCR技术在肉类和物种鉴定应用中得到了快速发展，成为肉类成分分析的主要技术。但是，PCR反应必须经过变性、退火、延伸3个步骤的多次循环，每个步骤均在不同的温度下进行，需要复杂的控制温度升降设备，必须在专业的实验室才可以实现，一定程度上限制了它的应用和推广。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)技术是基于T4噬菌体基因组DNA的复制机制开发的一种新型体外核酸等温扩增技术。其原理是，重组酶与合适长度的核酸片段(引物)结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，并与其发生链的置换反应，在体系中加入聚合酶可启动DNA合成，在恒温条件下即可实现对模板上目标片段的指数式扩增。与传统的聚合酶链式反应(PCR)相比，RPA技术能在恒温条件下扩增DNA，省去了反复升温和降温步骤，摆脱了对核酸扩增仪的依赖，使核酸扩增不再受仪器设备和场地限制，变得更加便捷。RPA的产物可直接通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，也可结合荧光探针进行实时定量检测，或与测流层析试纸条、微流控芯片等方法结合进行检测。目前，基于RPA技术建立的检测方法广泛应用于病原检测与疾病诊断、食品安全检测和转基因作物检测等多个领域。
技术实现思路
本专利技术提供了恒温条件下准确、快速、灵敏地从肉制食品中检测猪肉成分的实时荧光RPA检测方法。包括用于RPA检测的试剂，引物及特异性荧光标记探针。本专利技术的第一个目的是提供用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物对和探针，所述引物对为：上游引物：5’-TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC-3’下游引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC-3’；其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T；所述探针为：5’-CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT-Fam]G[THF]C-[dT-BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]-3’。其中，dT-Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，dT-BHQ1表示带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3spacer表示间臂。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂，所述RPA扩增试剂包括权利要求1所述的引物对以及探针。作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂中的终浓度为10μM。本专利技术的第三个目的是提供用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂盒，所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物对以及探针。作为优选，所述RPA试剂盒还包括猪标准DNA质粒，所述猪标准DNA质粒的制备方法为：以标准猪DNA为模板，以权利要求1所述的引物对为上下游引物，进行PCR扩增，将扩增产物纯化后，连接载体，转化入感受态细胞培养，提取质粒。本专利技术的第四个目的是提供上述的引物对和探针、RPA试剂、RPA试剂盒在如下任一中的应用：(1)检测或辅助检测猪肉成分；(2)制备检测或辅助检测猪肉成分的产品；(3)检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分；(4)制备检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分的方法，包括以下步骤：提取肉制品中的DNA作为待检DNA，以待检测DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，读取荧光数值，当反应管中荧光值高于阈值时，则判定肉制品中含有猪肉成分。作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时的温度为39-40℃，恒温20min。本专利技术具有以下优点：(1)只需要在39-40℃下恒温反应即可，不需要额外的设备；(2)反应时间仅需20min；(3)结果易于判断；(4)特异性好，灵敏度高。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为分别以标准猪、牛、羊、马、鸡、狗源性DNA1.0μL和水为模板，进行恒温实时荧光反应。S型扩增曲线对应的样品为猪标准DNA。图2为以系列标准品为模板，进行恒温实时荧光反应的扩增曲线。图3为以系列标准品为模板，进行恒温实时荧光反应，根据Cq值绘制的标准曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。在下述实施例中，所使用的主要材料包括RPAexo检测试剂，DNA提取试剂盒等，如无特殊说明，均可从公司购买获得。实施例1用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及试剂盒一、用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物及探针的设计与合成在GenBank中获取猪、牛、羊、马、鸡、狗等多种动物的线粒体全基因组序列，通过序列比对，根据RPA检测法中对引物的要求(RPA对引物长度要求为30-35nt，这就容易导致在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响)，经比对后筛选出12SrDNA上的一段序列，设计出一对通用性引物12S-F和12S-R，根据不同物种这段序列的差异，筛选猪特异性探针序列，对探针序列内部碱基进行必要的荧光基团、错配和3’末端终止修饰以适合RPAexo试剂的检测要求。序列如下：12S-F：5’-TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC-3’12S-R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC-3’12S-P：5’-CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT-Fam]G[THF]C-[dT-BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]-3’其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T。dT-Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物对和探针，其特征在于：所述引物对为：上游引物：5’‑TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC‑3’下游引物：5’‑CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC‑3’；其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T；所述探针为：5’‑CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT‑Fam]G[THF]C‑[dT‑BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]‑3’；其中，dT‑Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，dT‑BHQ1表示带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3spacer表示间臂。

【技术特征摘要】
1.用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物对和探针，其特征在于：所述引物对为：上游引物：5’-TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC-3’下游引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC-3’；其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T；所述探针为：5’-CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT-Fam]G[THF]C-[dT-BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]-3’；其中，dT-Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，dT-BHQ1表示带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3spacer表示间臂。2.一种用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂，其特征在于：所述RPA扩增试剂包括权利要求1所述的引物对以及探针。3.根据权利要求2所述的RPA试剂，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂中的终浓度为10μM。4.用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂盒，其特征在于：所述RPA试剂盒包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓霞，刘萍，李明生，张德荣，丁功涛，刘振斌，马忠仁，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62