【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及卵泡膜细胞分离，更具体地说，涉及绵羊卵泡膜细胞。
技术介绍
1、绵羊卵泡膜细胞是一种位于绵羊卵泡中的细胞类型，它们位于卵泡膜层，是卵泡组织中的一部分。绵羊卵泡膜细胞在生殖生物学研究中具有重要作用。它们可以用于研究卵泡发育、排卵、受精和胚胎发育等过程。此外，在生殖医学中，绵羊卵泡膜细胞也被用于辅助生殖技术，如体外受精和胚胎移植等。
2、绵羊卵泡膜细胞分离难度较大，现对于绵羊卵泡膜的分离技术还不成熟，如何实现绵羊卵泡膜细胞的分离同时保证分离纯度和活性，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，用以解决上述
技术介绍
中存在的技术问题。
2、本专利技术技术方案提供一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，包括如下步骤：
3、s1：获取有腔卵泡并置于培养皿中，用无菌注射器戳破卵泡释放颗粒细胞，抽取培养液反复冲洗膜组织以洗去黏附的颗粒细胞，体式显微镜下使用白金环刮除壁层颗粒细胞并使用眼科镊剥离卵泡外膜和基底膜，pbs缓冲液冲洗内膜组织3次；
4、s2：将内膜组织剪成糊状组织碎屑，转移至离心管内加入等体积的1％ⅳ型胶原酶，每20min震荡消化体系；消化后加入等量的含10％fbs的dmem/f12培养基终止消化并吹打混匀，然后进行过滤和离心，缓慢弃去上清液，细胞沉淀中加入培养液并缓慢重悬细胞，用移液枪枪尖挑出离心聚集成团的胶原酶；
5、s3：将2ml 44％percoll离心
6、s4：将细胞重悬后加入适量培养液，台盼蓝染色计数，调整细胞密度为2×106个/ml，细胞接种至培养皿进行培养，6h换液以除去未贴壁的细胞，之后每间隔48h换液1次，直至细胞贴壁至80％以上时进行传代培养；
7、s5：通过免疫荧光染色法对贴壁至80％以上时的细胞进行鉴定。
8、在一个优选地实施例中，s1种获取有腔卵泡的过程为：使用有齿镊纵向撕开卵巢，在卵巢组织应力和施加的外力中使得卵泡整体与皮质分离，使用眼科镊剥离直径3-8mm的有腔卵泡，并置于盛有适量的37℃细胞培养液的培养皿中。
9、在一个优选地实施例中，s2中组织悬液经70μm细胞滤网过滤，滤液在2500×g离心5min。
10、在一个优选地实施例中，s4中的细胞培养条件为：在培养皿中加入适量含15％fbs的dmem/f12培养液，在38℃、饱和湿度、5％co2培养箱中的条件下培养。
11、在一个优选地实施例中，s4中细胞传代培养的过程为：细胞传代培养时弃去培养液，pbs缓冲液缓慢洗涤细胞，加入适量体积的0.25％的胰蛋白酶消化液，37℃消化至细胞变成圆形且大部分细胞悬浮于消化液时加入等体积含10％fbs的培养液终止消化，吹打混悬细胞悬液后转移至离心管内，2000×g离心5min，缓慢弃去上清液，加入适量含15％fbs的dmem/f12培养液重悬后按照1:2的比例进行传代培养，每间隔48h换液1次。
12、在一个优选地实施例中，免疫荧光染色步骤为：
13、a1，固定：弃去细胞培养液，用pbs缓冲液洗涤3次，每次2min；加入250μl多聚甲醛固定30min，弃去固定液，pbs缓冲液洗涤3次，每次2min；
14、a2，透膜：加入250μl 0.2％triton x-100，室温孵育15min，弃去液体后用pbs缓冲液洗涤3次，每次2min；
15、a3，一抗孵育：每孔各加入稀释后的一抗工作液，阴性对照孔加入等量pbs缓冲液即可，置于4℃冰箱孵育12h，pbs缓冲液洗涤3次，每次5min；
16、a4，二抗孵育：每孔加入稀释后的二抗工作液500μl，置于暗室内，室温孵育3h后用pbs缓冲液洗涤3次，每次5min；
17、a5，dapi染核：暗室中每孔加入200μl dapi染色液，室温孵育1min，用pbs缓冲液洗涤3次，每次5min。
18、本专利技术技术方案的有益效果是：
19、本方案中的膜组织从直径3-8mm卵泡中剥离得到，原代tcs培养24h，贴壁量较少，细胞呈不规则多边形，72h后贴壁完全，贴壁细胞呈纤维索状，形态一致、分布均匀，可进行传代培养。
20、通过荧光照片量化结果显示，培养细胞vimentin蛋白阳性率为98.26±0.73％，cytokeratin蛋白阳性率为4.86±0.08％，fshr阳性率为0.55±0.94％，证实所分离的细胞为tcs，纯度高。
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1.一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，S1种获取有腔卵泡的过程为：使用有齿镊纵向撕开卵巢，在卵巢组织应力和施加的外力中使得卵泡整体与皮质分离，使用眼科镊剥离直径3-8mm的有腔卵泡，并置于盛有适量的37℃细胞培养液的培养皿中。
3.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，S2中组织悬液经70μm细胞滤网过滤，滤液在2500×g离心5min。
4.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，S4中的细胞培养条件为：在培养皿中加入适量含15％FBS的DMEM/F12培养液，在38℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中的条件下培养。
5.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，S4中细胞传代培养的过程为：细胞传代培养时弃去培养液，PBS缓冲液缓慢洗涤细胞，加入适量体积的0.25％的胰蛋白酶消化液，37℃消化至细胞变成圆形且大部分细胞悬浮于消化液时加入等体积含10％FBS的培养
6.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，免疫荧光染色步骤为：
...【技术特征摘要】
1.一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，s1种获取有腔卵泡的过程为：使用有齿镊纵向撕开卵巢，在卵巢组织应力和施加的外力中使得卵泡整体与皮质分离，使用眼科镊剥离直径3-8mm的有腔卵泡，并置于盛有适量的37℃细胞培养液的培养皿中。
3.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，s2中组织悬液经70μm细胞滤网过滤，滤液在2500×g离心5min。
4.根据权利要求1所述的一种绵羊卵泡膜细胞的分离鉴定方法，其特征在于，s4中的细胞培养条件为：在培养皿中加入适量含15％fbs的dmem/f1...
【专利技术属性】
技术研发人员：霍生东，麻俊渊，杨亚华，张涛杰，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：
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