一种脱细胞异体真皮基质及在口腔疾病中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种脱细胞异体真皮基质及在口腔疾病中的应用。本发明专利技术属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体是一种脱细胞异体真皮基质在唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面的应用。本发明专利技术的脱细胞异体真皮基质是经过工艺改进的产品，产品的机械性能适用于手术，缝合强度16N‑18N；具有无免疫排斥反应、快速诱导组织再生、植入后质地柔软、无轮廓感、体内相容性好、稳定的支架或模版作用。

Acellular allogenic dermal matrix and its application in oral diseases

The invention relates to an acellular allogenic dermis matrix and its application in oral diseases. The present invention belongs to the technical field of tissue engineering of biological medical materials, in particular a kind of acellular allogenic dermis matrix in cleft lip and / or alveolar cleft, cleft palate, oral mucosa defect repair, gingival defect, gingiva retraction repair, nasal mucosa repair, dental implant surgery, root bifurcation lesion repair, tooth extraction after extraction of impacted teeth and so on. The application of prevention of complications. The acellular dermal matrix of the present invention is an improved product. The mechanical properties of the product are suitable for operation and the suture strength 16N 18N; it has the effect of no immune rejection, rapid induction of tissue regeneration, soft, non contours, good compatibility and stencil in the body after implantation.

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞异体真皮基质及在口腔疾病中的应用
本专利技术属于生物医用材料的组织工程
，具体是一种脱细胞异体真皮基质在唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面的应用。
技术介绍
口腔黏膜缺损修复主要采用局部邻近转移黏膜瓣、颊脂垫瓣、游离皮肤移植等，等自体组织修复，虽然易于成活，但也存在一些缺陷：对自体的供区和受区的功能与外形的影响，愈合后会导致术后明显瘢痕畸形；二期修复，手术创伤大，需在机体其他部位切取移植组织，且常引起供区不同程度的功能障碍及并发症，引起患者痛苦和病程等负面影响。拔牙术，是一种常见的口腔外科手术，适用于多生牙、智齿阻生等牙齿疾病。拔牙后局部牙槽骨发生改建和吸收，骨量减少，导致后期临床修复效果不佳，如何减少和预防拔牙后牙槽骨的吸收以及拔牙后并发症一直是口腔颌面外科医生关注的热点。脱细胞异体真皮基质补片，取自人类异体的片状或膜状组织，是通过脱细胞技术，对生物真皮进行生物和化学处理，完全脱除各种可被宿主识别的、能够引起免疫排斥反应的细胞成分，如果移植用的皮肤是含有细胞的，那么移植后内皮细胞的免疫反应可能导致血管收缩、组织缺血和组织变性坏死，一旦经过脱细胞处理，将人体组织变成没有细胞的基质与支架，这种材料就会产生免疫惰性，因此不会发生免疫排斥反应，同时完整地保留了细胞外基质成分及其三维空间框架结构。中国专利技术专利CN1562388A将人的异体或哺乳类物的膜状或片状组织经脱细胞处理成具有三维空间结构的细胞外基质，具体方法为：从人或哺乳类动物体上取所需膜状组织或片状组织；将获得的组织用戊二醛和/或甲醛固定；用碱性溶液对组织进行脱细胞处理；用缓冲液对组织进行洗涤，获得细胞外基质；将细胞外基质在氨基酸溶液中进行孵育。然而，用戊二醛和/或甲醛固定，因戊二醛或甲醛具有胞毒性，导致了使用它们进行交联的生物组织在植入人体后，在一定程度上影响了受体正常组织的生长，进而影响伤口的愈合和功能的恢复；采用的碱性溶液对组织进行脱细胞处理，尤其是氢氧化钠或氢氧化钾是强碱，会造成脱细胞异体真皮基质中的胶原蛋白在碱性条件下水解。基于以上缺陷，研究一种安全无毒、脱细胞异体真皮基质完整的，能够用于唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面的脱细胞异体真皮基质或口腔补片具有实际意义。
技术实现思路
为了适应唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面手术需要，提供合适的口腔补片材料，本专利技术经过酶处理、表面活性剂超声处理、DNA降解处理等多步骤协同操作，专利技术制备了一种新的脱细胞异体真皮基质材料，并将其制作成口腔补片，用于上述疾病的预防或治疗。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，包括如下步骤：步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶，或者所述酶为磷脂酶和蛋白酶；步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；步骤五，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，振荡处理，得半成品E；步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；步骤七，将半成品F用注射用水清洗浸泡，得成品G；即为脱细胞异体真皮基质；可以直接作为口腔补片使用或用作制备口腔补片的材料。一般地，可将上述方法制得的脱细胞异体真皮基质保存于生理盐水中；为延长其保存期，也可进行灭菌处理(例如辐照灭菌)。为便于上述脱细胞异体真皮基质的储存及运输，延长其有效期，进一步地，上述方法还包括以下步骤：步骤八，将成品G取出，包装，灭菌，得成品H；或者将成品G取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥；包装，灭菌，得成品H。进一步地，步骤一中所述蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶(中性蛋白酶，分散酶)等中的一种或多种。在某些实施方式中，前述步骤一中的酶为磷脂酶、或磷脂酶与胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。进一步地，所述酶溶液pH值为7.0-8.0。优选地，磷脂酶浓度为0.1g/L-0.4g/L，和/或所述蛋白酶(或其中胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶任一种)的浓度为0.1g/L-0.3g/L。更进一步地，所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的一种或多种，优选磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的质量比为1:1:1:1。在某些实施方式中，前述步骤一振荡处理条件为振荡0.5-4小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。在某些实施方式中，前述步骤三所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的SDS(十二烷基硫酸钠)，或所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。进一步地，超声浸泡条件为：40-80KHz，100-400W，温度为1-20℃，超声3-8分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。在某些实施方式中，前述步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-8g/L，pH7.0-8.0；优选浓度为4-6g/L。在某些实施方式中，前述步骤五中振荡处理条件为振荡2-8小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。在某些实施方式中，所述步骤二、步骤四、步骤六振荡处理条件为振荡1-2小时，振荡转速为80-150rpm，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次，温度为1-5℃。在某些实施方式中，所述步骤七注射用水清洗浸泡条件为振荡2小时，振荡转速为80-150rpm，温度为1-5℃，更换注射用水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。在某些实施方式中，步骤八所述冻干保护剂溶液包括磷酸盐缓冲液、透明质酸和糖，其中透明质酸的浓度为0.4-0.8mg/100mL，糖的浓度为10-20mg/100mL，所述糖为海藻糖、乳糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨醇、甘露糖、葡萄糖等中的一种或几种。所述磷酸盐缓冲溶液(PBS)可按本领域常规方法配制，优选为10mmol/LpH7.0磷酸盐缓冲液。所述冷冻干燥步骤具体为：将成品G于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa。在某些实施方式中，前述步骤八的包装为将成品G装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。在符合本领域常识本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶，或者所述酶为磷脂酶和蛋白酶；步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；步骤五，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，振荡处理，得半成品E；步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；步骤七，将半成品F用注射用水清洗浸泡，得成品G；或者，进一步地，还包括以下步骤：步骤八，将成品G取出，包装，灭菌，得成品H；或者将成品G取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥；包装，灭菌，得成品H。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶，或者所述酶为磷脂酶和蛋白酶；步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；步骤五，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，振荡处理，得半成品E；步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；步骤七，将半成品F用注射用水清洗浸泡，得成品G；或者，进一步地，还包括以下步骤：步骤八，将成品G取出，包装，灭菌，得成品H；或者将成品G取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥；包装，灭菌，得成品H。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的一种或多种，更优选地，所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D按照质量比为1:1:1:1的混合物；和/或，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述酶溶液pH值为7.0-8.0；和/或，优选地，磷脂酶浓度为0.1g/L-0.4g/L；和/或，优选地，所述蛋白酶的浓度为0.1g/L-0.3g/L。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤一振荡处理条件为振荡0.5-4小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤三所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的SDS，或所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的TritonX-100；优选地，超声浸泡条件为：40-80KHz，100-400W，温度为1-20℃，超声3-8分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-8g/L，pH7.0-8.0；优选浓度为4-6g/L；和/或，所述步骤五中振荡处理条件为振荡2-8小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二、步骤四、...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙继煌，石清东，
申请(专利权)人：北京桀亚莱福生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11