制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法技术

本公开的主题提供了连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的方法，该方法包括：使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到该封闭室中；以及使第一流和第二流在该封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使该一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和该一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。还公开了由本公开的方法生产的组合物以及用于生产该组合物的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备聚电解质络合物纳米颗粒的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年6月6日提交的美国临时申请第62/346,001号、2016年2月29日提交的美国临时申请第62/301,149号和2015年8月13日提交的美国临时申请第62/204,739号的权益，每一个申请的内容通过引用以其整体并入本文。联邦政府资助的研究或开发本专利技术根据由美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)(NIH)授予的R21EB013274和R02E018358在政府支持下进行。政府在本专利技术中具有一定权利。背景开发用于疾病的检测和治疗的基因治疗的前景对于许多临床应用，包括癌症、免疫缺陷和代谢紊乱，仍然很高(Ginn等人，2013；Peer等人，2007)。基于病毒的递送系统包括迄今为止用于基因治疗临床试验的大多数基因载体(genecarrier)；然而，安全问题激发了对设计替代的递送系统的需求(Ginn等人，2013；Yin等人，2014)。已经开发了非病毒性基因递送方法来克服与病毒有关的主要限制，例如关于致命的全身性免疫应答、插入诱变、有限的DNA载体尺寸(limitedDNAvectorsize)以及与大规模生产病毒相关的问题的可能性(Yin等人，2014；Baum等人，2004)。聚合物纳米颗粒是最广泛使用的非病毒性载体，因为它们保护DNA免于降解并且改善了感兴趣的基因的细胞内递送和转染率(Bertrand等人，2005；Mura等人，2005；Bonnet等人，2008)。聚电解质络合物(PEC)由于其捕获治疗剂的能力已经被用于药物递送。在被开发用于基因治疗应用的所有聚合物中，线性聚乙烯亚胺(lPEI)经常被使用，因为它在体外和体内都展示出高的基因递送效率。此外，与其支化的PEI对应物相比，lPEI具有更好的安全性特性(Bonnet等人，2008；Jere等人，2001；Patnaik等人，2001)。其还主要通过组织特异性施用途径，在若干临床试验中被测试(例如，NCT01274455和NCT00595088)(Buscail等人，2015)。虽然已经有越来越多的努力以通过分子工程和纳米颗粒优化来改善lPEI作为DNA递送载体的物理化学性质和生物性能，但是临床应用的进展已受到缺乏用于组装这些络合物纳米材料的可再现的和可缩放的方法的阻碍。以涡旋或移液(pipetting)的形式的批量混合(bulkmixing)在实验室环境中被广泛使用；但是由于它们的差的微量混合环境，它们常常由于不可控的聚集体而导致在制备批次内或在批次之间的高度的可变性(Mangraviti等人，2013；Mangraviti等人，2015；Mastorakos等人，2009；Mastorakos等人，2015；Valencia等人，2012；Yang等人，2013；Murday等人，2009)。例如，最近的研究报告了，通过常规批量方法的纳米颗粒制剂的批次体积显著地影响PEI/siRNA纳米颗粒尺寸，其中较大的制剂溶液体积导致较大和较宽的颗粒尺寸范围(Lim等人，2014)。因此，开发通过其能够可再现地调整DNA纳米颗粒性质而不损害生物性能的生产方法是最重要的。已经报告了具有不同设计的微流体装置，目的是对颗粒尺寸及其分布提供更好的控制。例如，通过微流体装置制备的lPEI/siRNA纳米颗粒显示出与通过批量混合制备的那些相比在体外显著地更高的基因敲低效率(Lim等人，2014)。此外，当微流体混合的批量大小变化时，纳米颗粒性质不变。另一项研究使用微流体辅助的封闭空间(confinement)来制备聚阳离子/DNA纳米络合物(Ho等人，2011)。与批量制备相比，微流体制备导致纳米颗粒尺寸分布的减少，导致产生高度浓缩的(condensed)、紧凑的和稳定的纳米结构，导致细胞毒性的降低以及体外转染率的提高。然而，微流体系统可能具有一些局限性，例如需要配制用于纳米颗粒制剂的络合物材料以及由于微流体通道的小尺寸造成的有限的生产能力(<7.2g每天)(Kolishetti等人，2010；Romanowsky等人，2012)。瞬时纳米沉淀法(flashnanoprecipitation)(FNP)提供了连续的并且可缩放的工艺，该工艺已经被用于生产嵌段共聚物纳米颗粒。此工艺使用快速微量混合条件(大约1毫秒)来建立均相的过饱和条件以及使用嵌段共聚物自组装的疏水性溶质(有机或无机的)的受控的沉淀(Johnson等人，8月J.Chem.，2003；Johnson等人，Phys.Rev.Lett.，2003；Johnson等人，AicheJ.，2003；Shen等人，2011)。与批量制备方法相比，此工艺允许在连续流动操作过程中形成具有可调尺寸的均匀的聚集体，这适合于扩大规模生产。这个工艺还提供了对于颗粒尺寸及分布的更高程度的通用性和控制、更高的药物包封效率、以及改善的胶体稳定性(Shen等人，2011；D'Addio等人，2013；D'Addio等人，2011；D'Addio等人，2012；Gindy等人，2008；Lewis等人，2015；Luo等人，2014；Santos等人，2014)。然而，与嵌段共聚物纳米颗粒相比，聚电解质络合物的组装是由“络合反应(complexationreaction)”驱动的，这与两亲性共聚物通过FNP方法在水介质中的组装大不相同。似乎这样的PEC纳米颗粒不太可能可预见地用FNP方法组装。因此，本领域仍然期望找到用于制备PEC纳米颗粒的方法，该方法导致与使用FNP的嵌段共聚物纳米颗粒的性质相当的性质。概述除非另有说明，否则本专利技术的实施通常将使用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术。这些技术中的某些的非限制性描述见于以下出版物：Ausubel,F.等人,(编辑),CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocolsinImmunology,CurrentProtocolsinProteinScience和CurrentProtocolsinCellBiology,全部是JohnWiley&Sons,N.Y.,截至2008年12月的版本；Sambrook,Russell,和Sambrook,MolecularCloning.ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.,Antibodies—ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1988；Freshney,R.I.,“CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique”,第5版,JohnWiley&Sons,Hoboken,N.J.,2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息见于Goodmanan本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的瞬时纳米络合(FNC)方法，所述方法包括：(a)使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；(b)使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到所述封闭室中；以及(c)使所述第一流和所述第二流在所述封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.13 US 62/204,739;2016.02.29 US 62/301,149;1.一种连续地生成均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的瞬时纳米络合(FNC)方法，所述方法包括：(a)使包含一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物的第一流以第一可变流量流入到封闭室中；(b)使包含一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物的第二流以第二可变流量流入到所述封闭室中；以及(c)使所述第一流和所述第二流在所述封闭室中撞击，直到雷诺数为从约1,000至约20,000，从而使所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物和所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物经历连续地生成PEC纳米颗粒的聚电解质络合过程。2.一种均匀的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒制剂，由权利要求1所述的方法生成。3.如权利要求1-2中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第一流和所述第二流在进入所述封闭室时是在相对侧上，并且其中所述第二流的流量与所述第一流的流量的比率是从约1至约10。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第一流和/或所述第二流还包含一种或更多种水溶性治疗剂。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，还包括使第三流流入到所述封闭室中，其中当进入所述封闭室时，每个流与其他两个流是等距的。6.如权利要求1-5中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第三流包含一种或更多种水溶性治疗剂、一种或更多种可混溶的有机溶剂、和/或一种或更多种冷冻保护剂。7.如权利要求1-6中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的PEC纳米颗粒包封所述至少一种或更多种水溶性治疗剂。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述一种或更多种水溶性治疗剂选自由以下组成的组：小分子、碳水化合物、糖、蛋白质、肽、核酸、抗体或其抗体片段、激素、激素受体、受体配体、细胞因子和生长因子。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述一种或更多种水溶性聚阳离子聚合物选自由以下组成的组：壳聚糖、PAMAM树状聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、鱼精蛋白、聚(精氨酸)、聚(赖氨酸)、聚(β-氨基酯)、阳离子肽及其衍生物。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述一种或更多种水溶性聚阴离子聚合物选自由以下组成的组：聚(天冬氨酸)、聚(谷氨酸)、带负电荷的嵌段共聚物、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、透明质酸、藻酸盐、三聚磷酸盐(TPP)、寡聚(谷氨酸)、细胞因子、蛋白质、肽、生长因子和核酸。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述核酸选自由以下组成的组：反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、指导RNA、质粒DNA、载体DNA、mRNA、miRNA、piRNA、shRNA和siRNA。12.如权利要求1-11中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第一可变流量、所述第二可变流量和所述第三可变流量如果存在的话，是大于约5毫升/分钟。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述雷诺数在从约2,000至约8,000的范围内。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述雷诺数在从约3,000至约5,000的范围内。15.如权利要求1-14中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第一流的pH值和所述第二流的pH值在从约2.5至约8.4的范围内。16.如权利要求1-15中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所述第一流的pH值和所述第二流的pH值在从约3.5至约7.4的范围内。17.如权利要求1-16中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约20nm至约500nm的尺寸范围内。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约25nm至约100nm的尺寸范围内。19.如权利要求1-18中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径在从约25nm至约60nm的尺寸范围内。20.如权利要求1-19中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的直径是约30nm。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法或纳米颗粒制剂，其中所生成的聚电解质络合物(PEC)纳米颗粒的多分散指数在从约0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛海泉，约瑟·路易斯·桑托斯，任勇，约翰迈克尔·威利福德，
申请(专利权)人：约翰霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：美国,US