一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗鸭病毒性肝炎(DVH)党参多糖磷酸化分子修饰法及其应用，属于中兽药制备技术领域。提取筛选出对抗鸭病毒性肝炎有较好治疗效果的党参多糖80％醇沉部位用正交法确定三聚磷酸钠‑三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖有效部位的最佳条件为：反应温度90℃，反应时间8h，pH7.5；经红外光谱分析所得产物为党参多糖磷酸酯，其糖含量达72.82％，磷酸根含量达16.03％，产物得率达162％。党参多糖有效部位磷酸酯抗DHV‑1感染鸭胚肝细胞作用和对DVH的疗效优于党参多糖有效部位。本发明专利技术所获得的抗DVH党参多糖有效部位磷酸酯具有较高的糖和磷酸根含量，及较高产物得率，对DVH有良好疗效。

An anti duck virus hepatitis Codonopsis polysaccharide phosphorylation molecular modification method and its application

The invention relates to an anti duck virus hepatitis (DVH) Codonopsis pilosula polysaccharide phosphorylation molecular modification method and its application, belonging to the technical field of Chinese veterinary medicine preparation. The optimum conditions for determining the effective part of Codonopsis pilosula with sodium tripolyphosphate and sodium phosphate three phosphoric acid molecular modification by extracting and screening the 80% alcohol precipitation parts with good therapeutic effect against duck viral hepatitis are: the reaction temperature is 90, the reaction time is 8h, pH7.5, and the product of the infrared spectrum analysis is Codonopsis. The content of polysaccharide phosphate is 72.82%, the content of phosphate is 16.03%, and the yield of product is 162%. The effective fraction of Polysaccharide from Codonopsis pilosula is resistant to DHV 1, and the effect of DVH on the infected duck embryo hepatocytes is better than that of Polysaccharides from Codonopsis pilosula. The phosphate ester obtained from the effective part of the anti DVH Codonopsis pilosula polysaccharide has higher sugar and phosphate content and higher product yield, and has good curative effect on DVH.

【技术实现步骤摘要】
一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法及其应用一、
本专利技术涉及一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法，属于中兽药制备
二、
技术介绍
鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、DuckAstrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80％，甚至可高达100％，是严重危害养鸭业主要病原之一。目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现，即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化分子修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强。党参是一种经典的补气用中药。大量的现代药理学研究和普遍的临床应用结果表明，党参多糖是其主要有效成分之一，具有良好的提高免疫的作用。虽然有学者发现，经过硫酸化修饰的硫酸化党参多糖对鸡传染性法氏囊病毒和猪圆环病毒等表现出良好的抑制作用。但是，由于其多糖分子量较大，水溶性并不好，对制剂和应用造成一定的困难。我们课题组发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多糖成分分子修饰物的活性和溶解性往往大相径庭。本课题组前期研究发现，磷酸化修饰后多糖的抗病毒活性和水溶解性得到显著提升，为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有一定效果的党参多糖80％醇沉部位采用磷酸化分子修饰，并利用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用率。本专利技术首次对党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位采用正交法优化了磷酸化分子修饰条件，发现磷酸化分子修饰能显著增加党参多糖有效部位抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题，提供一种党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的磷酸化分子修饰方法，所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％，且对鸭病毒性肝炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的防治。技术方案采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位党参多糖，经数次临床试验发现党参多糖乙醇浓度80％醇沉部分(CPPS80)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对CPPS80的磷酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位(CPPS80)的磷酸化分子修饰方法为：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg党参多糖有效部位CPPS80加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化党参多糖。经NicoletFT-IR200型傅立叶变换红外光谱仪分析为党参多糖磷酸酯pCPPS80。按此方法制备的党参多糖磷酸酯含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％。所获得的党参多糖磷酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，且其作用均优于未修饰的党参多糖CPPS80。有益效果病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40％以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80％，甚至可高达100％，造成的损失难以估量。党参多糖是党参的主要药效成分，具有良好的抗病毒、提高免疫等作用，目前已经开发成为兽医临床用抗病毒药物和提高免疫用药物。广泛的兽医临床试验发现，许多补益类中药多糖对猪圆环病毒、繁殖呼吸综合征病毒、鸡传染性法氏囊病毒等有较好的疗效，但对鸭病毒性肝炎、鸡新城疫等瘟疫疗效却不稳定。已有的研究发现党参多糖硫酸化分子修饰物具有更良好的抗病毒作用，但硫酸化分子修饰操作相对复杂，刺激性大，修饰物水溶性欠佳，生物利用度也有限。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高党参多糖的水溶性和生物利用度，本专利技术采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位CPPS80，所形成的党参多糖磷酸酯pCPPS80不仅磷酸根和磷酸酯多糖含量高，产物得率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为方便。与现有技术相比，本专利技术优点如下：1.多糖磷酸化分子修饰的方法国内虽有3篇报道[1.李益，钱慈，郭明，梁东军.香菇多糖磷酸化修饰的工艺研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2013，30(5)：664-670；2.孙雪，潘道东，曾小群，曹锦轩.浒苔多糖的磷酸化修饰工艺[J].食品科学，2011，32(24)：73-77；3.张难，吴远根，莫莉萍，邱树毅，王文平.香菇多糖磷酸化修饰工艺条件的研究[J].食品与发酵工业，2007，33(12)：63-67]，但此3文并不是对党参多糖进行修饰，更不是对有效作用部位进行修饰，所选的工艺方法为响应面法，本法采用的正交筛选，获得的最佳修饰条件也不同。且最根本的在于本专利技术所修饰的党参多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位CPPS80，目前国内外尚未见相似研究。2.通过本专利技术实施所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80含量达72.82％，磷酸根含量为16.03％，产物得率达162％，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。3.通过本专利技术实施所获得的党参多糖磷酸酯pCPPS80不仅对鸭肝炎病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法及其应用，采用三聚磷酸钠‑三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖，其特征在于：(1)采用水煎醇沉法，提取党参多糖不同醇沉部位后经临床试验筛选出对鸭病毒性肝炎有较好治疗效果的80％醇沉部位CPPS80；(2)抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰的方法：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg党参多糖有效部位CPPS80加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠‑三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化党参多糖。

【技术特征摘要】
1.一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰法及其应用，采用三聚磷酸钠-三偏磷酸钠法磷酸化分子修饰党参多糖，其特征在于：(1)采用水煎醇沉法，提取党参多糖不同醇沉部位后经临床试验筛选出对鸭病毒性肝炎有较好治疗效果的80％醇沉部位CPPS80；(2)抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰的方法：精确称取2.5000g三聚磷酸钠和1.0000g三偏磷酸钠，溶于50ml蒸馏水中；精密称取250mg党参多糖有效部位CPPS80加入至100ml蒸馏水中，充分溶解后将配好的三聚磷酸钠-三偏磷酸钠混合液50ml加入，调节pH＝7.5～9，置恒温水浴锅内，反应温度70℃～90℃、反应时间4～8h，反应结束后，将反应物先用自来水透析48h，再用蒸馏水透析24h，冷冻干燥后得磷酸化党参多糖。2.根据权利要求1所述的一种抗鸭病毒性肝炎党参多糖磷酸化分子修饰的方法，其特征在于，磷酸化分子修饰党参多糖的最佳条件为：反应温度90℃、反应时间8h、pH7.5；在最佳条...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘家国，明珂，杜红旭，陈云，王德云，武毅，胡元亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32