一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液技术

本发明专利技术公开了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。髓过氧化物酶(MPO)校准品利用本发明专利技术的冻干保护液冻干后不缩水，能维持冻干前形状；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘冻干粉；冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生；冻干前后活性基本保持不变；可以显著提高髓过氧化物酶校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，延长MPO检测试剂盒的保存时间。

【技术实现步骤摘要】
一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液
本专利技术涉及生化试剂
，具体涉及一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液。
技术介绍
目前国内髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒中的校准品多为液体，MPO抗原在液态下容易发生变性，虽然加入一些保护剂(如一些蛋白、糖类及抗氧化剂等)能够延长MPO抗原在液态下的保存时间，但MPO抗原在保护剂存在的情况下放置2-8℃保质期一般为6-12个月。国内外有部分MPO校准品也有冻干形式存在，冻干后的MPO抗原稳定时间长，准确度高，但价格较高；有部分试剂盒使用的是一个高浓度的MPO冻干校准品，复溶后的高浓度MPO校准品稳定性相对较好，但实验过程为获得不同浓度的MPO校准品需要增加稀释过程，增加了实验误差；还有些试剂盒中虽然用到冻干的MPO校准品，但复溶后储存时间短，2-8℃只能存放2天，-20℃保存30天。因此总体上，现有技术存在的缺点：1)MPO抗原中加入的保护剂本身在液态条件下会存在不稳定现象，不能很好地保护MPO抗原；2)液体的MPO校准品储存时间相对较短，限制了MPO试剂盒的有效期。3)液体MPO校准品储存温度一般为2-8℃，运输过程需要使用冰袋或冷链运输，增加了运输过程的成本。4)冻干MPO校准品复溶稳定性差；5)冻干MPO校准品仅在较高浓度下稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法及冻干保护液，以解决髓过氧化物酶校准品储存时间短、运输不便；冻干品复溶性差的问题。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。上述冻干保护液中牛血清白蛋白(BSA)具有低温保护剂和脱水保护剂的作用，能够对MPO抗原起到很好的保护作用。甘露醇可以作为填充剂，也含有多个羟基，可以替代水与MPO抗原的亲水基团形成氢键，保护好MPO抗原的空间结构及避免凝聚。蛋白稳定剂对蛋白类的抗原均有保护作用，避免冻干过程及复溶后的活性损失。聚乙二醇能够提供框架结构，提高冻干后的韧性，有利于维持冻干后的形态。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)相对于EDTA具有较好的溶解性，能够鳌合一些金属离子，避免金属离子对MPO抗原中氨基酸的氧化。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述聚乙二醇的平均分子量为10000～40000，优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为20000。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白0.5％～3％、甘露醇0.5％～5％、蛋白稳定剂0.1％～1％、聚乙二醇0.2％～2％和乙二胺四乙酸二钠0.05％～0.4％。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白1.0％、甘露醇0.5％、蛋白稳定剂0.5％、聚乙二醇0.5％和乙二胺四乙酸二钠0.2％。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述冻干保护剂还包括缓冲液、色素和防腐剂，所述缓冲液的浓度为10～50mM，所述色素的重量百分数为0.002％～0.01％，所述防腐剂的重量百分数为0.01％～0.2％。上述技术方案中缓冲液可提供一个较为稳定的pH，避免MPO抗原的凝聚。防腐剂对细菌和霉菌均有抑制生长作用，能够提高冻干抗原复溶后的稳定性。色素对MPO检测没有干扰，将色素添加在MPO校准品中能够与其它试剂区分，可以避免在实验操作过程中加样误差。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述色素为亮蓝、胭脂红、日落黄、柠檬黄、焦糖色、β-胡萝卜素、葡萄皮红、胭脂虫红或栀子蓝。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠、生物防腐剂中的至少一种。作为本专利技术所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的优选实施方式，所述缓冲液的pH为7.2～7.6。本专利技术还提供了一种髓过氧化物酶冻干校准品的制备方法，包括以下步骤：(1)将髓过氧化物酶校准品与权利要求1～9任一项所述的冻干保护液混合，作为髓过氧化物酶校准品的冻干液，所述冻干液中髓过氧化物酶校准品的浓度不低于5ng/mL；(2)将步骤(1)的冻干液置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解吸干燥阶段；预冻阶段：温度降至-30℃并维持3～4h；升华干燥：温度由-30℃升至-15℃，升温时间为1h，在-15℃干燥12～15h，真空度维持在30Pa以下；解吸干燥：温度由-15℃升至25℃，升温时间为2h，在25℃干燥3～5h，真空度维持在15Pa以下；(3)冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到所述髓过氧化物酶冻干校准品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)冻干外形：冻干后不缩水，能维持冻干前形状；不粘瓶；韧性较好；瓶塞不粘冻干粉。2)复溶性：加入纯化水后静止10s，冻干品能够完全溶解，溶液澄清，无块状及泡沫产生。3)冻干前后活性及复溶后活性：MPO校准品冻干前后活性基本保持不变，与冻干前活性差异在5％以内。冻干品在37℃放置30天和开瓶4℃放置30天检测结果偏差在5％以内。4)冻干MPO校准品可以显著提高MPO校准品的稳定性，有利于冻干抗原的运输，延长MPO校准品的保存时间，从而延长MPO检测试剂盒的保存时间。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。HEPES为羟乙基呱嗪乙硫磺酸，非离子两性缓冲液，能较长时间控制恒定的pH范围；TAPS为三羟甲基甲胺基丙磺酸；MOPS为3-(N-吗啉)丙磺酸。实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术的蛋白稳定剂购自科跃中凯；生物防腐剂KY100购自科跃中楷。实施例1作为本专利技术所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：磷酸缓冲液20mM(pH为7.4)、牛血清白蛋白1.0wt％、甘露醇1.0wt％、蛋白稳定剂0.5wt％、聚乙二醇200000.5wt％、乙二胺四乙酸二钠0.2wt％、柠檬黄0.005wt％和KY1000.1wt％。实施例2作为本专利技术所述髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液的一种实施例，本实施例的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液包括如下浓度和重量百分数的组分：MOPS缓冲液10mM(pH为7.2)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇5wt％、蛋白稳定剂1wt％、聚乙二醇100000.2wt％、乙二胺四乙酸二钠0.4wt％、亮蓝0.002wt％、ProClin3000.005wt％和KY本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。

【技术特征摘要】
1.一种髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括牛血清白蛋白、甘露醇、蛋白稳定剂、聚乙二醇和乙二胺四乙酸二钠。2.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为10000～40000，优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为20000。3.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白0.5％～3％、甘露醇0.5％～5％、蛋白稳定剂0.1％～1％、聚乙二醇0.2％～2％和乙二胺四乙酸二钠0.05％～0.4％。4.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护液包括下述重量百分数的组分：牛血清白蛋白1.0％、甘露醇0.5％、蛋白稳定剂0.5％、聚乙二醇0.5％和乙二胺四乙酸二钠0.2％。5.根据权利要求1～4任一项所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述冻干保护剂还包括缓冲液、色素和防腐剂；所述缓冲液的浓度为10～50mM，所述色素的重量百分数为0.002％～0.01％，所述防腐剂的重量百分数为0.01％～0.2％。6.根据权利要求5所述的髓过氧化物酶冻干校准品的冻干保护液，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：段朝晖，罗宁，李民友，蓝媛，刘忠贵，
申请(专利权)人：广州市进德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44