MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品制造技术

本发明专利技术公开了一种MALDI‑TOF MS即用型质控活菌标准品，解决了现有的阳性对照菌株获得时间长的技术问题，属于质谱标准品的技术领域。该活菌标准品，通过以下步骤制备得到：(1)培养目的获得单菌落来源的二代菌株，鉴定确认种属正确；(2)收集新鲜二代菌株，悬浮于冻干保护剂中，制成活菌标准品母液；(3)稀释活菌标准品母液，计算活菌标准品母液中菌株浓度；同时，将稀释后的活菌标准品母液制成菌球，计算获得冻干存活率；(4)依据冻干存活率，制备含有目标菌数的质控活菌标准品，保存于‑20℃。本发明专利技术可以充分利用MALDI‑TOF MS鉴定菌株种属快速、高通量的特点，缩短微生物检验的时间，提高检验效率。

【技术实现步骤摘要】
MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品
本专利技术涉及质谱标准品的
，尤其涉及一种MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品。
技术介绍
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的依靠电离对菌株种属进行鉴定的质谱技术，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量且传递给生物分子，且电离过程中将电子转移到生物分子或从生物分子得到电子，带电的生物分子在电场作用下加速飞过飞行管道，且待测生物分子的质荷比(M/Z)与飞行时间成正比，从而根据到达检测器的飞行时间不同而对生物分子进行检测。MALDI-TOFMS技术由于具有快速、高通量等技术有点，在日常菌株鉴定种属方面备受青睐，从环境中菌株筛选到常见致病菌的快速鉴定，MALDI-TOFMS都在发挥越来越重要的作用。但是，MALDI-TOFMS对样品的鉴定结果一般分为几个等级，即对于某些菌株种属的鉴定只是可能性的判定，对于需要确定种属的菌株鉴定，尤其是需要出具书面报告的菌株，必须对菌种种属进行准确鉴定。如果设定阳性对照，可以将待测菌株和阳性对照菌株的峰图进行比对分析，以确定菌种种属。而阳性对照菌株，一般需要进行培养来获得，一代菌培养时间至少需要18h。而试验用菌株，尤其是对照菌株一般选择单克隆的二代菌株，所以可用的阳性对照菌株获得至少需要36h，这对于日常检验，尤其是应急检验，存在较大弊端。高效利用MALDI-TOFMS鉴定菌株种属快速、高通量等技术特点，确保菌株种属鉴定结果可靠，是提高检验效率的有效途径之一。通过对可疑菌株设定阳性对照，可以满足菌株种属鉴定准确的要求，如果避免阳性对照菌株的培养过程满足即时性要求，无疑是高效利用MALDI-TOFMS的重要方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有的MALDI-TOFMS用阳性对照菌株获得时间长的技术问题，提供一种MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品，可以充分利用MALDI-TOFMS鉴定菌株种属快速、高通量的特点，缩短微生物检验的时间，提高检验效率。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品，通过以下步骤制备得到：(1)培养目的获得单菌落来源的二代菌株，经过生化鉴定，确认种属正确；(2)收集新鲜二代菌株，悬浮于冻干保护剂中，涡旋使二代菌株分散成单个菌落，且经5μm滤膜进行过滤，除去未能分散成单个菌落细胞团，制成活菌标准品母液；(3)稀释活菌标准品母液，接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，结合稀释倍数计算活菌标准品母液中菌株浓度；同时，将稀释后的活菌标准品母液制成菌球，并将菌球接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，再与冻干前浓度进行比较，计算获得冻干存活率；(4)依据冻干存活率，制备含有目标菌数的质控活菌标准品，保存于-20℃，即为MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品。进一步地，步骤(2)所述冻干保护剂的组分包括蔗糖、葡糖糖和牛血清白蛋白。进一步地，步骤(3)所述菌球的制备方法为：取稀释后的活菌标准品母液以20μL/球的量滴入含有液氮的烧杯中进行速冻，然后置于冷冻干燥机中进行冻干14～18小时，再放入2mL的西林瓶中，将胶塞虚掩的盖在西林瓶上，然后用冷冻干燥机进行真空轧盖。进一步地，步骤(3)所述菌球的制备方法为：取稀释后的活菌标准品母液以20μL/球的量滴入含有液氮的烧杯中进行速冻，然后置于冷冻干燥机中进行冻干16小时，再放入2mL的西林瓶中，将胶塞虚掩的盖在西林瓶上，然后用冷冻干燥机进行真空轧盖。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品，是针对检验工作常见的菌种，如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等菌种，挑选来源明确、种属确定的菌株制备质控活菌标准品，可以即时地作为阳性对照，从而对实现对这些菌种快速可靠的鉴定。本专利技术提供的MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品，处理过程简单，即仅需要将活菌标准品溶解于去离子水中就可以直接进行使用，经由MALDI-TOFMS采集图谱检测，可作为待测菌株种属鉴定的参考菌株。本专利技术的MALDI-TOFMS即用性质控活菌标准品，既满足了MALDI-TOFMS菌株种属鉴定准确的要求，也避免了阳性对照菌株培养费时的弊端，从而提高微生物检验的时效性。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为待测菌落的质谱图；图2为本专利技术实施例提供的MALDI-TOFMS即用型质控金黄色葡萄球菌活菌标准品的质谱图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细介绍。本专利技术所述的菌株采用的是购自CMCC的金黄色葡萄球菌(CMCC26003)。金黄色葡萄球菌检验是日常微生物检验常见的检验项目，该菌在自然界中广泛存在，并且食品受到污染的机会很多，如常见的奶、肉、蛋、鱼及其制品都容易被污染。此外，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，加之多种食品容易受到污染，所以对人类健康存在巨大威胁。利用MALDI-TOFMS对可疑菌落进行鉴定，可以在数分钟内得到初步鉴定结果。但是一般需要对可疑菌落进行进一步的种属确认，而将制备好的MALDI-TOFMS即用型金黄色葡萄球菌活菌标准品经由前述去离子水溶解和前处理方法，由MALDI-TOFMS采集图谱，从而作为可疑菌落图谱的参考，即可以在数分钟内对可疑菌落的种属进行明确判断，避免了后续的生化鉴定和其他操作，缩短了检验时间，可以在数分钟内对可疑菌落进行准确鉴定。本专利技术实施例所述的MALDI-TOFMS即用型质控金黄色葡萄球菌活菌标准品，通过以下步骤制备得到：(1)培养目的获得单菌落来源的二代菌株，经过生化鉴定，确认种属正确；(2)收集新鲜二代菌株，悬浮于冻干保护剂中，涡旋使二代菌株分散成单个菌落，且经5μm滤膜进行过滤，除去未能分散成单个菌落细胞团，制成活菌标准品制备母液；(3)稀释活菌标准品母液，接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，结合稀释倍数计算活菌标准品母液中菌株浓度；同时，将稀释后的活菌标准品母液制成菌球，并将菌球接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，再与冻干前浓度进行比较，计算获得冻干存活率；(4)依据冻干存活率，制备含有目标菌数的质控活菌标准品，保存于-20℃，即为MALDI-TOFMS即用型质控金黄色葡萄球菌活菌标准品。其中，步骤(2)所述冻干保护剂的组分包括蔗糖、葡糖糖和牛血清白蛋白。其中，步骤(3)所述菌球的制备方法为：取稀释后的活菌标准品母液以20μL/球的量滴入含有液氮的烧杯中进行速冻，然后置于冷冻干燥机中进行冻干16小时，再放入2mL的西林瓶中，将胶塞虚掩的盖在西林瓶上，然后用冷冻干燥机进行真空轧盖。使用时，用100ul去离子水溶解MALDI-TOFM本文档来自技高网...

【技术保护点】
MALDI‑TOF MS即用型质控活菌标准品，其特征在于，通过以下步骤制备得到：(1)培养目的获得单菌落来源的二代菌株，经过生化鉴定，确认种属正确；(2)收集新鲜二代菌株，悬浮于冻干保护剂中，涡旋使二代菌株分散成单个菌落，且经5μm滤膜进行过滤，除去未能分散成单个菌落细胞团，制成活菌标准品母液；(3)稀释活菌标准品母液，接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，结合稀释倍数计算活菌标准品母液中菌株浓度；同时，将稀释后的活菌标准品母液制成菌球，并将菌球接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，再与冻干前浓度进行比较，计算获得冻干存活率；(4)依据冻干存活率，制备含有目标菌数的质控活菌标准品，保存于‑20℃，即为MALDI‑TOF MS即用型质控活菌标准品。

【技术特征摘要】
1.MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品，其特征在于，通过以下步骤制备得到：(1)培养目的获得单菌落来源的二代菌株，经过生化鉴定，确认种属正确；(2)收集新鲜二代菌株，悬浮于冻干保护剂中，涡旋使二代菌株分散成单个菌落，且经5μm滤膜进行过滤，除去未能分散成单个菌落细胞团，制成活菌标准品母液；(3)稀释活菌标准品母液，接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，结合稀释倍数计算活菌标准品母液中菌株浓度；同时，将稀释后的活菌标准品母液制成菌球，并将菌球接种于平板培养基中，经培养对菌落进行计数，再与冻干前浓度进行比较，计算获得冻干存活率；(4)依据冻干存活率，制备含有目标菌数的质控活菌标准品，保存于-20℃，即为MALDI-TOFMS即用型质控活菌标准品。2.根据权利要求1所述的MALDI-TOFM...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔生辉，刘娜，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11