一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸合成菌株，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因和应用
本专利技术属于微生物和基因工程
，具体地说涉及一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因和应用。
技术介绍
反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-proline，trans-Hyp）为亚氨基酸，是L-脯氨酸(L-Pro)羟基化后的产物，易于衍生，药理活性多样，可用于新一代培南类抗生素、抗肿瘤药、抗高血压药及新型胃药等多种新创制药物的合成。由于具有抗氧化、抗辐射的作用，该物质在化妆品领域也有重要应用。反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法主要有生物提取法和生物酶催化转化法。生物提取法主要以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换树脂纯化等过程制备，此方法虽然技术成熟，但原料成本高，提取率低，“三废”排放量大、污染严重。生物酶催化法利用脯氨酸羟化酶的催化特性，以L-脯氨酸或葡萄糖为原料通过发酵转化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。生物转化法与生物提取法相比反应条件温和，能耗低，污染小。目前，已有报道具有反式-4-羟基-L-脯氨酸合成功能的菌株，包括：螺旋聚孢属菌(Clonostachyscylindrospora)，链霉菌(Streptomycete)，灰略红链霉菌P-8648(Streptomycesgriseoviridus)，指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.strainRH1)。从指孢囊菌中分离得到的编码脯氨酸羟化酶(P4Hs)的基因被广泛应用在大肠杆菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的基因工程菌的构建当中。例如专利文件（申请号201510899127.6）中公开了一种用于生产反式反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，该菌株是由L-脯氨酸羟化酶基因（来源于指孢囊菌），野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酞磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到表达载体上，再利用RED重组技术将其整合到大肠杆菌基因组得到重组菌株。将该重组菌株应用于羟脯氨酸的发酵生产，经检测，发酵70h后，发酵液中羟脯氨酸的浓度为28.8g/L，L-脯氨酸的浓度为2.4g/L。由此可见，采用现有方法（真菌来源的编码脯氨酸羟化酶(P4Hs)的基因及其重组菌株）生产效率较低，且L-脯氨酸的残留量偏高。目前尚未获得具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的单纯细菌菌株及新型羟化酶基因的分离。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的单纯细菌株，以期现有方法所存在的问题。本专利技术的目的之二在于提供一种源于上述菌株的、具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的L-脯氨酸羟化酶基因，以进一步克服现有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产方法效率低、合成产物中的L-脯氨酸残留量高等问题。本专利技术的目的之三在于提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因的用途。本专利技术的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）HBU-AI，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14164，保藏日期为2017年5月17日。本专利技术的HBU-AI菌株是由空气中获得的，其获取方法如下：（1）配制50g/L的L-脯氨酸标准水溶液，并在20℃~30℃条件下，于空气中开放放置一周。（2）将溶液用无菌水梯度稀释至10-7，选取稀释梯度为10-3、10-4、10-5的稀释液100µL涂布到LB平板上，30℃恒温培养2d。（3）经观察不同稀释度下菌落形态相似，分别挑取单菌落于含有L-脯氨酸的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养，48h后将发酵液于9000r/min，离心2min，分别获得相对应菌落的上清液。（4）检测各个菌落的L-脯氨酸转化活性：分别取相对应菌落的上清液50μL加入到1.5mL离心管内，向离心管内加入0.125mol/L四硼酸钠水溶液200μL、纯水410μL、乙腈320μL，0.38mol/LFMOC-Cl的乙腈溶液20μL，置于涡旋混匀器震荡5s后静置10min，最后过0.45μm微孔滤膜于RP-HPLC分析。液相条件如下：色谱柱为AgilentExtendC-18（4.6mm×250mm，5μm，Agilent公司），流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液，检测波长263nm，进样量5μL；梯度洗脱条件如下：0–5min（30%B），5–8min（30%–40%B），8–15min（40%B），15–20min（40%-50%B），20–25min（50%B），25–30min（50%–90%B），30–38min（90%B），38–41min（90%-30%B），41–45min（30%B）。（5）选取转化活性较高的菌株作为候选菌株并验证各菌株的转化活性，L-脯氨酸转化活性的检测方法同第（4）步，检测结果如表1所示。表1：结果表明：从空气中获得的3号菌株是一株能够高效转化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株，其转化效果如图1所示，该菌株转化3g/L的L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的浓度为1.86g/L，得到此菌株转化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率为62.0%。3号菌株的鉴定对获得的具有羟化酶活性的单菌落进行菌体形态观察、生理生化分析，并对菌株进行16SrDNA序列分析。菌株分类学特征分别为：菌落直径2~3毫米，白色菌落，较干燥，边缘不整齐，在LB液体培养基中培养时，菌体在光学显微镜下呈短小直杆；利用API50CH试剂盒检测时，菌株能利用D-核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺、水杨苷、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、七叶灵枸橼酸铁。根据16srDNA序列对上述筛选得到的菌株构建系统发育树，如图2所示，利用API50CH试剂盒对上述菌株进行API检测，最终将该菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，编号为HBU-AI。对该菌株进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14164，保藏日期为2017年5月17日。一种来源于上述反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株的L-脯氨酸羟化酶基因，所述L-脯氨酸羟化酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，命名为Bp4h。一种含有上述L-脯氨酸羟化酶基因的重组载体。进一步地，所述重组载体为上述L-脯氨酸羟化酶基因、L-谷氨酸激酶基因以及L-谷氨酰磷酸还原酶基因共表达的重组载体；其中，L-谷氨酸激酶基因（ProB）和L-谷氨酰磷酸还原酶基因（ProA）均来源于大肠杆菌DH5a菌株。一种由上述重组载体构建的工程大肠杆菌BL21（DE3）。含有上述的L-脯氨酸羟化酶基因的工程菌的构建方法，包括以下步骤：（1）L-脯氨酸羟化酶基因Bp4h的扩增：对L-脯氨酸羟化酶基因Bp4h序列设计引物对，F-Bp4h，如SEQIDNO.2所示和R-Bp4h，如SEQIDNO.3所示，采用PCR技术扩增得到Bp4h片段；（2）L-谷氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸合成菌株，其特征是，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株，其特征是，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）HBU-AI，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14164，保藏日期为2017年5月17日。2.一种来源于权利要求1所述反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株的L-脯氨酸羟化酶基因，其特征是，所述L-脯氨酸羟化酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种含有权利要求2所述的L-脯氨酸羟化酶基因的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征是，所述重组载体为所述L-脯氨酸羟化酶基因、L-谷氨酸激酶基因以及L-谷氨酰磷酸还原酶基因共表达的重组载体。5.一种由权利要求3或4所述的重组载体构建的工程大肠杆菌BL21（DE3）。6.一种含有权利要求2所述的L-脯氨酸羟化酶基因的工程菌的构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玮，张红蕾，张超，裴朝红，韩孟楠，徐志栋，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北,13