序列变体制造技术

氨基酸残基错误导入必然发现在表达多肽混合物的低浓度的序列变体中，其由转录和/或翻译期间易于氨基酸残基错误导入的密码子中的一个或多个碱基错配产生。本发明专利技术提供了一种优化编码多肽的多核苷酸的编码序列的方法，其中至少一个密码子易于氨基酸残基错误导入。本发明专利技术的方法可用于逆向工程化编码相同多肽但在所述至少一个密码子上与已知编码序列不同的未知编码序列。该方法还可用于改变表达多肽的免疫原性潜力。因此，本发明专利技术可用于工程化编码多肽的优化多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列变体
本专利技术涉及优化编码多肽的多核苷酸的编码序列的方法，其中至少一个密码子易受氨基酸残基错误导入。该方法可用于对第二、未知编码序列(其编码相同多肽、但在所述至少一个密码子上与已知编码序列不同)的至少一个密码子进行逆向工程化。本专利技术的方法还可用于改变表达的多肽的免疫原性潜力。最后，本专利技术还包括用于工程化编码多肽的优化多核苷酸的方法。
技术介绍
蛋白质治疗在治疗各种病症中越来越普遍。为了使这些产品在患者中安全、可再现和有效，将给定多核苷酸序列高保真转录和翻译成“正确的”氨基酸多肽产物、产生高均质性的产物对于在任何表达系统或宿主细胞(包括大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中制药生产人类蛋白质是至关重要的。基本上在每种表达的蛋白质中都可以发现低丰度的蛋白质序列变体，其与用于表达的多核苷酸相应的编码区编码的氨基酸一级序列具有不同的氨基酸一级序列，并且导致蛋白质治疗中产物依赖性的杂质。这些低丰度的序列变体是由于在转录和/或翻译期间核苷酸错配引起的氨基酸残基错误导入产生。在转录和/或翻译水平上的核苷酸错配是否导致由错误导入引起的不同氨基酸残基的交换，例如，Gly→Glu或Gly→Asp，主要依赖于编码性多核苷酸序列水平上的编码所述氨基酸残基的密码子类型。多肽产物的“正确”或天然编码氨基酸序列的任何异质性或偏差可导致显著的缺点，包括较低质量、增加纯化精力、改变治疗功效和/或改变免疫原性，例如增加免疫原性。通过在任何表达系统中表达获得的两种蛋白质产物在上述特征中可能基本上不同，即使它们各自的编码序列高度相似或几乎相同，但在蛋白质相同的相应位置上，编码相同氨基酸的至少一个密码子不同。因此，不是通过表达完全相同的编码序列所获得的蛋白质产物可以显示不同的免疫学特性，例如诱导针对所述蛋白质的抗体形成和/或不同的药理学性质，例如不同的半衰期或不同的药代动力学。由于这些原因，期望获得一种方法，其可用于提供或多或少容易发生氨基酸错误导入的编码序列，或者提供已知的、先前表征和/或市售的蛋白质产物的未知的编码序列，以便与所述已知产物的氨基酸残基错误导入的程度或类型完全匹配。这种方法的后一方面在生物仿制药的开发中特别相关，其中产物的蛋白质序列是完全已知的，或者可以通过常规方法在实验中容易地确定，但是编码多核苷酸序列或其一部分是专有的、未公开的或未知的。在原始蛋白质治疗剂和/或相应的生物仿制治疗剂中低水平序列变体的杂质程度或类型可能是非常显著的。Yu等人，Anal.Chem.2009,81,9282–9290描述了导致形成多肽的低水平序列变体的基于质谱的分析和分子机制，其包括错误导入的氨基酸。Yu等人解释说，包含至少一个错误导入的氨基酸的多肽的低水平序列变体的大多数是由转录或翻译期间的至少一种非Watson-Crick碱基错配引起的。然而，Yu等人并没有教导例如通过鉴定和选择未知第二多核苷酸的至少一个密码子以优化编码多肽的多核苷酸的编码序列，所述未知第二多核苷酸编码相同多肽、但至少所述一个密码子不同。换句话说，Yu等人没有想到未知编码序列的至少一个密码子的逆向工程化。更一般地说，由于与任何活的生物体内遗传信息流相关的分子生物学的中心法则以及由于遗传密码的简并性，至今为止不认为从编码的蛋白质序列推导编码RNA或DNA序列是可能的。因此，生物制药工业中需要用于优化编码多肽的编码序列的方法，其通过逆向工程化编码已知蛋白质产物的未知编码多核苷酸序列或其部分的至少一个密码子。此外，生物药物和蛋白质治疗剂的免疫原性活性尤其是生物技术工业中常遇到的问题。具体地说，针对许多蛋白质药物现在已经描述了在生物药物中存在T细胞表位和发生抗药物抗体(ADA)，证明T细胞表位含量是导致抗原性的重要因素(Shankar等人，NatBiotechnol2007，25(5)：555-61；Nechansky&KircheisExpertOpin.DrugDiscov2010，5(11)：1067-1079；Harding等人，MAbs2010，2(3)：256-65)。T细胞(T辅助细胞；CD4+细胞)活化的一个关键决定因素是T细胞表位与主要组织相容性复合物(MHC的II型或HLA)分子的结合强度(Weber等人，AdvDrugDelivRev.2009，30；61(11)：965-76)。已经进行了相当大的努力以通过使用计算机工具预测潜在的T细胞表位来估计和降低蛋白质治疗剂的免疫原性潜力(Roque-Navarro等人，HybridHybridomics2003,22(4)：245-57；Tangri等人，CurrentMedicinalChemistry2002,9：2191-9；Mateo等人，Hybridoma2000,19(6)：463-71；DeGroot等人，Vaccine2009，27：5740-7)。基于预测的肽序列的MHCII结合强度，可以对肽序列引起免疫应答的可能性做出知情决定。然而，多肽药物的免疫原性潜力的预测、改变或降低迄今仅限于可通过表达和/或纯化步骤获得的“主要”或天然多肽，即根据表达该多肽的生物体或宿主生物体使用的遗传密码，由相应的多核苷酸的编码序列编码的氨基酸序列。然而，上述引用的现有技术没有理解或解决在多肽药物总量的相当大部分中一级氨基酸序列可以不同的问题，其归因于错误转录和/或错误翻译事件导致的在主要或天然多肽的低水平序列变体中的一个或多个氨基酸残基错误导入。本领域还没有认识到这种氨基酸残基的错误导入可能显著影响相应多肽药物的免疫原性潜力。同时，迄今尚未执行或建议基于错误导入的氨基酸(和所得肽序列)的免疫原性潜力的密码子选择。更具体地说，蛋白质药物中氨基酸错误导入的免疫原性潜力也未包括在现有技术对改变(即，降低或增加)多肽的免疫原性潜力(例如减少ADA的形成)的尝试中。总之，普遍需要提供密码子优化的核苷酸序列的改进方法，所述密码子优化的核苷酸序列编码具有改变的、特别是降低的免疫原性潜力的多肽。特别地，需要一种用于获得编码多肽药物的优化的编码序列的方法，当导入受试者时，所述多肽药物与由非优化的多核苷酸表达的多肽相比，引发降低的ADA应答。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于优化编码多肽的多核苷酸的编码序列的方法，所述方法包括(a)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上错误导入氨基酸残基；(b)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上错误导入氨基酸残基，并选择所述至少一个密码子的替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；(c)将所述编码序列中的至少一个密码子改成替代密码子，其中所述至少一个密码子易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上错误导入氨基酸残基，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；或(d)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上错误导入氨基酸残基，将所述密码子改成替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型。在一个实施方案中，在细胞中表达多核苷酸时所述至少一个密码子易于导入错误氨基酸残基。在一个实施方案中，细胞是细菌细胞或真核细胞。在一个优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于优化编码多肽的多核苷酸的编码序列的方法，所述方法包括(a)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入；(b)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，并选择所述至少一个密码子的替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；(c)将所述编码序列中的至少一个密码子改成替代密码子，其中所述至少一个密码子易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；或(d)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，并将所述密码子改成替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.22 EP 14199893.01.一种用于优化编码多肽的多核苷酸的编码序列的方法，所述方法包括(a)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入；(b)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，并选择所述至少一个密码子的替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；(c)将所述编码序列中的至少一个密码子改成替代密码子，其中所述至少一个密码子易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型；或(d)鉴定在所述编码序列中的至少一个密码子，其易于在所编码多肽中对应于所述密码子的位置上氨基酸残基错误导入，并将所述密码子改成替代密码子，以改变氨基酸残基错误导入的程度或类型。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括确定在以下中发现的氨基酸残基错误导入的程度或类型：(a)通过表达待优化的所述多核苷酸获得的多肽；和/或(b)通过表达第二多核苷酸获得的多肽，所述第二多核苷酸编码相同的多肽但在所述至少一个密码子上与待优化的多核苷酸不同。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中分别选择所述替代密码子，或改变所述至少一个密码子，以与通过表达第二多核苷酸获得的多肽中发现的氨基酸残基错误导入的程度或类型相匹配，所述第二多核苷酸编码相同的多肽但在所述至少一个密码子上与待优化的多核苷酸不同。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括确定通过表达第二多核苷酸获得的多肽中发现的氨基酸残基错误导入的程度或类型，所述第二多核苷酸编码相同的多肽但在所述至少一个密码子上与待优化的多核苷酸不同，和其中分别选择所述替代密码子，或改变所述至少一个密码子，以与通过表达所述第二多核苷酸获得的所述多肽中发现的氨基酸残基错误导入的程度或类型相匹配，所述第二多核苷酸编码相同的多肽但在所述至少一个密码子上与待优化的多核苷酸不同。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸残基错误导入导致所述多肽的免疫原性潜力增加。6.根据权利要求1或5所述的方法，其中所述替代密码子的选择或所述至少一个密码子的改变分别导致所述多肽的免疫原性潜力降低。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述免疫原性潜力在计算机模拟、在体外或在体内确定。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中氨基酸残基错误导入以小于表达多肽总摩尔量的约1％、小于约0.5％、小于约0.2％、小于约0.1％或小于约0.02％存在。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中氨基酸残基错误导入是在转录或翻译期间至少一个非Watson-Crick碱基错配的结果。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一个非Watson-Crick碱基错配选自由：(a)DNA模板链和从所述DNA模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·霍尔茨曼，M·富克斯，C·阿克穆勒，H·托尔，
申请(专利权)人：桑多斯股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH