用于将非天然氨基酸并入蛋白质中的平台制造技术

本发明专利技术提供了一套tRNA和蛋白质翻译系统，其使得能够并入非天然部分(例如非天然氨基酸)而不损害将所有二十种天然氨基酸并入蛋白质的能力。这通过将通常由至少两种不同的tRNA反密码子解码的氨基酸的tRNA反密码子之一重新分配给非天然部分来实现，其中至少一个密码子可以被重新分配的反密码子独特地识别并且至少另外一个来自同一个密码子框的密码子不能被重新分配的反密码子识别。因此，用于翻译的mRNA被工程化以包含对应于重新分配的tRNA反密码子的一个或多个特定密码子，使得非天然部分在选定位置被并入翻译的蛋白质中。

A platform used to incorporate non natural amino acids into protein

The invention provides a set of tRNA and protein translation system, so that it can be incorporated into non natural parts (such as non natural amino acids) without damaging all twenty natural amino acids incorporated into the protein. This will usually by one of at least two different tRNA anticodon decoding amino acid tRNA anticodon redistribution to the non natural part to achieve, including at least one codon anticodon can be redistributed uniquely identified and at least one other from codon not the same codon frame the redistribution of the anticodon recognition. Therefore, the mRNA used for translation is engineered to contain one or more specific codons corresponding to the tRNA distribution of redistribution, so that the non natural part is incorporated into the translated protein at the selected location.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将非天然氨基酸并入蛋白质中的平台
本专利技术涉及蛋白质工程。更具体地，本专利技术涉及生产包含一个或多个非天然部分(如非天然氨基酸)以及所有二十种(20)天然氨基酸中的任何一种的重组蛋白。
技术介绍
蛋白质是所有有生命的生物体的核心功能成分。蛋白质由天然生物合成途径形成，该途径使用二十种(20)遗传编码的“天然”氨基酸的遗传学上确定的序列以形成这些蛋白质的结构单元。鉴于生产包含天然氨基酸的蛋白相对简单，因而迄今为止，蛋白质结构、功能和种类方面的研究进展大部分集中在天然结构、功能和种类。虽然人类基因组编码约30000种不同的蛋白质，但如果能够制造出包括天然氨基酸之外的结构部分(如非天然氨基酸、天然氨基酸的化学衍生物、具有化学反应性的部分等)的蛋白质，那么其种类可能会更加庞大。这些“非天然”蛋白质可被用来产生合成蛋白库、基于蛋白质的生物活性物(如药物)、生物治疗剂(如抗体、肽类激素、免疫调节剂)、检测或诊断试剂，它们具有在天然蛋白质中未发现的结构和活性。但是，这种“非天然”蛋白质的重组生产已被证明是一个困难的命题。一般而言，生产重组“非天然”蛋白质的方法依赖于对蛋白翻译过程进行操作(特别是在无细胞表达系统中进行)，这种操作破坏正交tRNA为蛋白质链延长的每个步骤提供特定的天然氨基酸的正常功能。通过酶解法或化学方法可用非天然氨基酸使正交tRNA氨酰化。酶法氨酰化需要使用正交氨酰tRNA合成酶(aaRS)。通常需要多轮定向进化才能生成可接收非天然氨基酸作为其底物的正交tRNA/aaRS对。虽然使用这些方法已将数百种非天然氨基酸并入到蛋白质中，但是它们大多数属于一个窄的结构类别(通过它们的“亲本”aaRS的特异性来界定)。与此概念明显不同的是使用能够在体外将非天然氨基酸负载到tRNA上的一种进化的tRNA酰化核酶(Flexizyme)。该方法是通过与tRNA的3’-端形成暂时的复合物来实现的，其中末端核糖的3’-OH与非天然氨基酸的活化的羧基碳通过亲核攻击而结合。此外，还开发了化学酰化tRNA方案。该方案可并入与天然氨基酸非常不同的化学官能团，因而难以通过aaRS途径来负载。虽然已开发出几种合成途径，但通常它们的产率低并且未广泛应用。其他方案集中于在蛋白质翻译过程中通过指定具有正交反密码子的tRNA来编码非天然氨基酸而并入非天然氨基酸。这还要求翻译的mRNA在非天然氨基酸要被并入的位置包括相应的“重新分配”的密码子。生成正交密码子的最常用方法是“无义抑制”，其使用遗传密码中的三个终止密码子:琥珀密码子、蛋白石密码子和赭石密码子。在一些生物体中，终止密码子可被通读并编码非天然氨基酸，例如UGA密码子编码硒代半胱氨酸，UAG密码子编码吡咯赖氨酸。该系统的主要缺陷在于释放因子与正交抑制tRNA的竞争导致蛋白质表达产率内在地降低。另一种方案是“移码抑制”。包含长的反密码子环的天然的移码抑制tRNA可读四碱基密码子，如UAGN和ACCN，并抑制+1阅读框移位。但是，通过四碱基密码子编码非天然氨基酸的方案的效率远不如使用无义抑制，目标蛋白质的产率因为四联密码子被误读为三联密码子而显著降低。近期的一个氨基酸并入策略是从遗传密码中排除某些氨基酸(如Phe)，从而生成可被指定至非天然氨基酸的“游离”密码子。但是，这导致氨基酸种类的减少。
技术实现思路
本专利技术广义上来说提供一种方法，通过该方法tRNA反密码子可从天然氨基酸被“重新分配”至非天然部分(例如非天然氨基酸)，从而能够生产包括一个或多个非天然部分的重组蛋白质而不损害将天然氨基酸并入该重组蛋白质的能力。在第一个方面，本专利技术提供一种生产适合于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的一套tRNA的方法，所述方法包括将至少一个包含天然氨基酸的反密码子的tRNA替换为至少一个包含相同但被重新分配为非天然部分的反密码子的tRNA，其中所述一套tRNA能够被操作而便于RNA的翻译，所述RNA包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，从而使得所翻译的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。适当地，该被重新分配的反密码子是该相同的天然氨基酸的多个不同反密码子中的一个。在第二个方面，本专利技术提供一种组合物，其包含适合于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的一套tRNA，所述一套tRNA包含至少一个含有非天然部分的反密码子的tRNA，所述非天然部分的反密码子由天然氨基酸的反密码子重新分配，其中该一套tRNA能够被操作而便于RNA的翻译，所述RNA包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，从而使得所翻译的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。适当地，该被重新分配的反密码子是该相同的天然氨基酸的多个不同反密码子中的一个。在第三个方面，本专利技术提供一种生产适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的翻译系统的方法，所述方法包括:生产包含至少一个tRNA的一套tRNA，该至少一个tRNA包含已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子；以及生产可转录RNA，其包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，其中该mRNA可被转录而生产出可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸的已翻译蛋白质。在第四个方面，本专利技术提供一种适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的翻译系统，所述系统包括:包含至少一个tRNA的一套tRNA，该至少一个tRNA包含已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子；以及可翻译mRNA，其包含与已被重新分配为非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，其中该mRNA可被转录而生产出可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸的已翻译蛋白质。在第五个方面，本专利技术提供一种生产包含至少一个非天然部分的重组蛋白质的方法，所述方法包括翻译mRNA的步骤，该mRNA包含与一套tRNA中的一个tRNA中已被重新分配为非天然部分的反密码子相对应的密码子，该tRNA包含至少一个含有已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子的tRNA，其中所翻译出的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。适当地，根据前述各个方面的任何一个的方法、组合物或系统，所述重新分配的反密码子是四倍或六倍简并的。适当地，根据前述各个方面的任何一个的方法、组合物或系统，所述重新分配的反密码子是Ile、Ala、Gly、Pro、Thr、Val、Arg、Leu或Ser的反密码子。在前述各个方面的任何一个的方法、组合物或系统的具体实施方式中，所翻译出的蛋白质可包含一个或多个相同或不同的非天然部分。在第六个方面，本专利技术提供一种由第五个方面的方法生产的重组蛋白质。将意识到的是，分离的蛋白质可包含一个或多个相同或不同的非天然部分，而便于PEG化、结合至小分子、标记、固定、分子间和/或分子内交联或其他相互作用、形成更高级别的结构和/或一个或多个催化活性，但不限于此。在一个实施方式中，所述重组蛋白质包含两个或更多个相同或不同的能够实现分子内共价键合的非天然部分。在一个特定实施方式中，所述重组蛋白质是大环状蛋白质(macrocyclicprotein)。本专利技术还提供编码第六个方面的所述重组蛋白质的mRNA分子。将意识到的是，不定冠词“一个(a)”和“一个(a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的一套tRNA的方法，所述方法包括将至少一个包含天然氨基酸的反密码子的tRNA替换为至少一个包含相同但被重新分配为非天然部分的反密码子的tRNA，其中所述一套tRNA能够被操作而便于RNA的翻译，所述RNA包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，从而使得所翻译的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.27 AU 20159011211.一种生产适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的一套tRNA的方法，所述方法包括将至少一个包含天然氨基酸的反密码子的tRNA替换为至少一个包含相同但被重新分配为非天然部分的反密码子的tRNA，其中所述一套tRNA能够被操作而便于RNA的翻译，所述RNA包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，从而使得所翻译的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括一个或多个以下步骤:(i)从适于包含天然氨基酸的蛋白质的翻译的一套tRNA中耗尽一种或多种tRNA；和(ii)以一个或多个分别被重新分配至非天然部分并且分别被连接至所述非天然部分的tRNA来重构该被耗尽的一套tRNA。3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(i)中，基本上所有天然氨基酸的tRNA都被从该套tRNA中耗尽。4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(i)中，一种或多种的天然氨基酸tRNA被选择性地从该套tRNA中耗尽。5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其中在步骤(ii)中，重构tRNA包含合成tRNA、天然tRNA或其混合物。6.一种组合物，其包含适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的一套tRNA，所述一套tRNA包含至少一个含有重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子的tRNA，其中该一套tRNA能够被操作而便于RNA的翻译，所述RNA包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，从而使得所翻译的蛋白质可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸。7.一种生产适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的翻译系统的方法，所述方法包括生产包含至少一个tRNA的一套tRNA，该至少一个tRNA包含已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子；以及生产可转录RNA，其包含与已被重新分配为所述非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，其中该mRNA可被转录而生产出可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸的已翻译蛋白质。8.一种适于包含至少一个非天然部分的蛋白质的翻译的翻译系统，所述系统包括:包含至少一个tRNA的一套tRNA，该至少一个tRNA包含已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码子；以及可翻译mRNA，其包含与已被重新分配为非天然部分的所述反密码子相对应的密码子，其中该mRNA可被转录而生产出可包含任何一种或全部二十种(20)天然氨基酸的已翻译蛋白质。9.一种生产包含至少一个非天然部分的重组蛋白质的方法，所述方法包括翻译mRNA的步骤，该mRNA包含与一套tRNA中的一个tRNA中已被重新分配为非天然部分的反密码子相对应的密码子，该一套tRNA包含至少一个含有已被重新分配为非天然部分的天然氨基酸反密码...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢尔盖·穆尔伊夫，正林·崔，基里尔·亚历山德罗夫，
申请(专利权)人：昆士兰大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU