一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用。CYP76B74蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。实验证明，CYP76B74蛋白与紫草素类化合物合成密切相关，其能将对苯二酚2‑香叶醌催化成为3”羟基‑对苯二酚2‑香叶醌。本发明专利技术对于调节生产植物萘醌类化合物和通过生物技术提高新疆紫草中萘醌类活性成分紫草素类的含量具有重要的理论和实际意义。

【技术实现步骤摘要】
一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用
本专利技术属于药用植物基因工程领域，具体涉及一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
药用植物活性成分通常是植物生长发育和适应环境过程中次生代谢产生的一类小分子有机化合物。活性成分生物合成途径的解析是药用植物次生代谢产物研究的核心内容。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johns是传统中药材紫草ArnebiaeRadix的重要来源，已被列为野生药材动植物资源三类保护品种。新疆紫草的有效化学成分主要分为两大类，一类是脂溶性的萘醌类化合物和紫草素类化合物；另一类是水溶性成分，主要是多糖类和酚酸类。现代药理学研究发现紫草素类化合物具有抗肿瘤、抗HIV活性、调节免疫、抗生育、抗血栓、镇静、促进伤口愈合等多种临床作用，在医药行业应用广泛。此外，紫草素更是重要的天然染料被国际上称为“天然红色素之王”，具有很高的经济价值。紫草素为萘醌类化合物。现有研究表明，硬紫草(L.erythrorhizon)细胞的微粒体蛋白中存在对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶(2-Geranylhydroquinone-3”-hydroxylase，GHQ3”H)，其可以将对苯二酚2-香叶醌(2-Geranylhydroquinone，GHQ)催化成为3”羟基-对苯二酚2-香叶醌(3”-Hydroxy-2-Geranylhydroquinone，3”HGHQ)。对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶是紫草素生物合成过程中的一个关键酶，它是单萜苯醌环化成萘醌前的一步关键的修饰。但是至今未获得对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的氨基酸序列。因此，编码对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的基因的克隆和功能研究是解析紫草素生物合成途径的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种参与紫草素生物合成的CYP76B74蛋白及其编码基因与应用。本专利技术提供了一种蛋白质，获自新疆紫草，命名为CYP76B74蛋白，可为如下f1)或f2)或f3)或f4)：f1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；f2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；f3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与紫草素合成相关的蛋白质；f4)与序列表中序列1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于新疆紫草且与紫草素合成相关的蛋白质。为了使f1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列上述f3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。本专利技术还保护编码CYP76B74蛋白的核酸分子(CYP76B74基因)。所述编码CYP76B74蛋白的核酸分子可为如下A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：A1)编码区是序列表中序列2所示的DNA分子；A2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于新疆紫草且编码CYP76B74蛋白的DNA分子；A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码CYP76B74蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。本专利技术还保护含有CYP76B74基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。本专利技术还保护CYP76B74蛋白，或，CYP76B74基因，或，含有CYP76B74基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用；具体可为如下c1)至c10)中至少一种：c1)作为对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶；c2)制备具有对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的功能的产品；c3)催化对苯二酚2-香叶醌；c4)制备用于催化对苯二酚2-香叶醌的产品；c5)将对苯二酚2-香叶醌催化成3”羟基-对苯二酚2-香叶醌；c6)制备用于将对苯二酚2-香叶醌催化成3”羟基-对苯二酚2-香叶醌的产品；c7)生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌；c8)制备用于生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌的产品；c9)生产紫草素类化合物；c10)制备用于生产紫草素类化合物的产品。上述应用中，所述c9)或c10)中，所述紫草素类化合物可为IVS、DMS、IBS、AOIVS、AS和HIVS中的至少一种。上述应用中，所述c7)或c8)中，所述“生产3”羟基-对苯二酚2-香叶醌”可以对苯二酚2-香叶醌作为底物。本专利技术还保护一种重组菌，是将CYP76B74基因导入宿主菌中得到的；所述宿主菌可为酵母。上述任一所述酵母可为K1)或K2)：K1)酿酒酵母；K2)酿酒酵母BY-T20。所述CYP76B74基因可通过含有CYP76B74基因的重组表达载体导入宿主菌。可用现有的表达载体构建含有CYP76B74基因的重组表达载体。使用CYP76B74基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；此外，使用CYP76B74基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组表达载体具体可为以质粒pESC-Trp为出发载体，将序列表的序列2所示的DNA分子插入到FLAG标签之前得到的重组表达载体。本专利技术还保护一种对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的制备方法，可包括如下步骤：培养所述重组菌，从培养产物中分离得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶。所述培养重组菌包括如下步骤：(a1)将重组菌接种至含20g/LD-葡萄糖的SD-His-Trp液体培养基中培养，得到菌液；(a2)将步骤(a1)培养后的菌液离心收集沉淀；(a3)使用含20g/L半乳糖的SD-His-Trp液体培养基重悬步骤(a2)得到的菌体，继续培养。步骤(a1)中，所述培养具体可为30℃、250rpm培养。步骤(a1)中，所述菌液OD600nm可为0.6。步骤(a2)中，所述离心具体可为4000g离心。步骤(a3)中，所述培养具体可为30℃、250rpm培养。步骤(a3)中，所述培养时间具体可为24h。所述培养重组菌还包括完成步骤(a3)后，收集培养体系，离心收集菌体沉淀。所述离心具体可为4000g离心。所述从重组菌中得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶的方法具体可为从所述菌体沉淀中提取酵母微粒体蛋白，得到对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶。所述提取酵母微粒体蛋白具体可采用玻璃珠法。本专利技术还保本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，为如下f1)或f2)或f3)或f4)：f1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；f2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；f3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与紫草素合成相关的蛋白质；f4)与序列表中序列1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于新疆紫草且与紫草素合成相关的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为如下f1)或f2)或f3)或f4)：f1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；f2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；f3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与紫草素合成相关的蛋白质；f4)与序列表中序列1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于新疆紫草且与紫草素合成相关的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：编码所述蛋白质的核酸分子为如下A1)或A2)或A3)或A4)所示的DNA分子：A1)编码区是序列表中序列2所示的DNA分子；A2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于新疆紫草且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，为如下c1)至c10)中至少一种：c1)作为对苯二酚2-香叶醌-3”羟化酶；c2)制备具有对苯二酚2-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，王升，郭兰萍，王瑞杉，刘谈，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11