一种NT-3转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于纳米微球控释体制备技术领域，特别是涉及一种NT‑3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用。采用纳米微球自组装技术将一种生物因子NT‑3基因转染到BMSCs，通过可降解生物材料壳聚糖构建成通透性更好的纳米微球控释体，从而得到NT‑3基因转染BMSCs纳米微球控释体，转染率更高，毒性更小，形态更加均匀，高分子生物亲和力更强，并且更加接近临床应用。

Preparation and application of a NT-3 controlled BMSCs nanoparticle controlled release agent

The invention belongs to the technical field of nano microsphere controlled release system, in particular to a preparation method and application of a NT 3 gene transfected BMSCs nanospheres controlled release body. A biofactor NT 3 gene was transfected into BMSCs by the self-assembly of nanospheres, and the biodegradable biomaterial chitosan was constructed into a better permeable nanomicrosphere controlled release body, and the transfected BMSCs nanospheres controlled release body was obtained by NT 3 gene transfection. The transfection rate was higher, the toxicity was smaller, the morphology was more uniform, and the polymer organisms were more homogeneous. It has stronger affinity and is closer to clinical application.

【技术实现步骤摘要】
一种NT-3转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用
本专利技术属于纳米微球控释体制备
，特别是涉及一种高效、无毒NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用。
技术介绍
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)发生率高、损害严重，由于中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)轴突损伤后再生能力低下难以自发性再生，神经元本身的再生能力不足和缺乏适宜的再生微环境等原因，SCI一直是世界性难题[1]。但是研究表明远离损伤部位的神经元和它们的近侧轴突损伤后仍然存活，目前应用细胞移植、给予外源性神经营养因子等多种方法改善损伤局部的微环境，可以促进损伤脊髓的神经纤维再生。因此，联合治疗、基因治疗等治疗策略应运而生，成为SCI治疗研究的重要方向。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)取材方便、不损伤正常组织，容易分离培养，具有较强的自我增殖和复制能力，并且经诱导可以分化为多种功能细胞，是理想的组织工程种子细胞。将骨髓间充质干细胞直接植入周围神经损伤断端,经过一段时间后通过检测植入骨髓间充质干细胞发现，其表达雪旺细胞的表型,且具有明显神经再生迹象。研究表明BMSCs移植到损伤神经，可以自身分泌或通过转基因的方法提供多种神经营养因子和神经递质,以促进损伤修复并减少细胞凋亡。神经营养因子3(neurotrophicfactor3NT-3)能维持交感神经元正常功能，促进并诱导突起向神经纤维生长，有趋化性，而且具有很强的运动神经元营养活性，可阻止轴突和运动终板退变，在治疗神经系统疾病和失神经肌萎缩中有临床应用前景。但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径。基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径。而药物纳米载体具有高度靶向、药物控制释放、提高难溶药物的溶解率和吸收率优点，提高药物疗效和降低毒副作用。纳米颗粒作为基因载体具有一些显著的优点：纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会象普通颗粒那样迅速地被吞噬细胞清除；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等。目前基本采用阳离子脂质体转染的NT-3，阳离子脂质体转染的NT-3虽为非病毒载体无免疫原性，但粒径不太均匀、形态不规整、个体较小，转染率也较低，从而大大降低了转染效率和生物因子的效率。也有部分采用腺病毒的，由于病毒载体有较强的免疫原性、潜在的感染性，因此使用受限。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高效、无毒NT-3基因通过壳聚糖生物材料转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法及其应用，解决了现有技术中的阳离子脂质体转染的NT-3形态不规整，个体较小，转染率低，安全性差的技术问题。具体技术方案是，所述NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法，包括以下步骤，将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用NaOH调节pH值至5.0-6.5；然后将上述溶液通过PBS磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3-7mmoL/L，其中PBS磷酸盐缓冲液是生物化学中常用的一种阻碍溶液pH变化的缓冲溶液，这种由盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，磷酸盐，氯化钾和磷酸钾组成。组份浓度：137mmoL/L氯化钠，2.7mmoL/L氯化钾；再接下来通过0.15-0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；将浓度为90-120μg/ml的pEGFP-C1溶解于3-8mmoL/L的Na2SO4中；将传代培养的BMSCs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与NT-3溶液混合；然后将二者,也就是将传代培养的BMSCs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中后得到的溶液与步骤(4)中得到的溶液与NT-3溶液混合后的溶液等体积分别加热至50-65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得NT-3基因转染的BMSCs纳米微球控释体。所得到的NT-3基因转染的BMSCs纳米微球控释体形态均匀，个体也较大，转染率也较高。壳聚糖(chitosan,CS)是近年来基因转染载体的研究热点之一兼具一切多聚阳离子聚合物优点的壳聚糖来源于甲壳动物的外壳，是一种纯天然无毒可降解和生物相容性好的多聚糖在酸性环境中，带正电荷的壳聚糖的氨基可与带负电荷的DNA的磷酸基相互吸引，进而形成聚合物，聚合物的表面呈正电荷，而细胞膜的双层磷脂结构使其表面带负电荷。因此，壳聚糖聚合物与带细胞膜由于静电相互吸引，当聚合物的大小达到一定的亚细胞或亚微米级别时，可被细胞胞吞入胞，并且更接近临床应用。NT-3基因高效转入BMSCs构建纳米微球控释体将使神经再生细胞和神经营养因子联合作用，保护基因不被核酸酶降解，提高靶向性，具有稳定、无毒、易包裹浓缩,高生物亲和性,实现基因治疗的特异性，有效地延长作用时间，转染效率高，无免疫排斥反应等特点。通过PLGA生物桥接管应用于周围神经缺损和脑中枢再造脊髓和周围神经再生的微环境。从分子生物学、细胞移植上为治疗脑中枢、脊髓及周围神经疾病提供实验理论基础和新的治疗思路。NT-3溶液的制备现有技术中有很多中方法，再次不再赘述。进一步的，步骤(1)中用NaOH调节pH值至5.5。进一步的，步骤(2)中乙酸浓度为5mmoL/L。进一步的，步骤(3)中将浓度为100μg/ml的pEGFP-C1溶解于5mmoL/L的Na2SO4中。进一步的，壳聚糖溶液和NT-3溶液的混合加热温度为55℃。进一步的，权利要求1-5中任一所述方法制备的NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体在治疗脊髓损伤药物中的应用。有益效果，通过本申请所提供的NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法，所得到的NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体转染率和安全性更高，毒性更小，形态更加规整、粒径更加均匀、相互无黏连，并且具有高生物亲和性也更加接近临床应用；当pH值为5.5，乙酸浓度为5mmoL/L时所得到的NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体个体更大，粒径也更加均匀；NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体在治疗脊髓损伤药物中可以使药物的通透性更好、靶向性更强，有效延长药物活性时间，另外可以载负生物因子使之与周围组织接触更加均匀，诱导周围细胞增殖分化，作为组织生长支架促进生长的作用。说明书附图为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例描述中所需的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，这些附图所直接得到的技术方案也应属于本专利技术的保护范围。图1是使用本申请方法得到的NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体的TEM。图2是使用现有技术阳离子脂质体转染的NT-3的TEM。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本专利技术的具体实施方式做详细说明。在下面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NT‑3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用NaOH调节pH值至5.0‑6.5；(2)将上述溶液通过PBS磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3‑7mmoL/L；(3)通过0.15‑0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；(4)将浓度为90‑120μg/ml的pEGFP‑C1溶解于3‑8mmoL/L的Na2SO4中；(5)将传代培养的BMSCs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与NT‑3溶液混合后；然后将二者等体积分别加热至50‑65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得NT‑3基因转染的BMSCs纳米微球控释体。

【技术特征摘要】
1.一种NT-3基因转染BMSCs纳米微球控释体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)将不同相对分子量的壳聚糖分别溶解于缓慢加热的1％乙酸溶液，待完全溶解后用NaOH调节pH值至5.0-6.5；(2)将上述溶液通过PBS磷酸盐缓冲液稀释到壳聚糖浓度为0.02％(w/v)，乙酸浓度为3-7mmoL/L；(3)通过0.15-0.35μm的过滤器进行过滤，得到壳聚糖溶液备用；(4)将浓度为90-120μg/ml的pEGFP-C1溶解于3-8mmoL/L的Na2SO4中；(5)将传代培养的BMSCs加入到步骤(3)所得到的壳聚糖溶液中；将步骤(4)中得到的溶液与NT-3溶液混合后；然后将二者等体积分别加热至50-65℃后，再进行混合，涡旋30s后静止30min，即得NT-3基因转染的BMSCs...

【专利技术属性】
技术研发人员：董玉珍，宗海斌，刘中何，路坦，李爱国，赵斌，安永博，
申请(专利权)人：董玉珍，
类型：发明
国别省市：河南,41