一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用，属于荧光检测技术领域。本发明专利技术的实体荧光纳米微球是由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12的摩尔比聚合而成。本发明专利技术将荧光分子嵌入到聚苯乙烯的空间网络中，得到的实体荧光微球具有微球间荧光强弱均匀一致、荧光强度高、信号放大倍数高等特点，由于微球表面没有荧光分子的阻碍，微球能与蛋白进行高效率、高产率的偶联。且该微球产生的荧光背景低，不会影响检测结果的精确性，可广泛应用于诊断试剂中。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用，属于荧光检测
。本专利技术的实体荧光纳米微球是由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12的摩尔比聚合而成。本专利技术将荧光分子嵌入到聚苯乙烯的空间网络中，得到的实体荧光微球具有微球间荧光强弱均匀一致、荧光强度高、信号放大倍数高等特点，由于微球表面没有荧光分子的阻碍，微球能与蛋白进行高效率、高产率的偶联。且该微球产生的荧光背景低，不会影响检测结果的精确性，可广泛应用于诊断试剂中。【专利说明】一种实体荧光纳米微球及其制备方法和应用
本专利技术涉及荧光检测
，具体涉及一种实体荧光纳米微球及其制备方法和在免疫定量层析中的应用。
技术介绍
侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线2?3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素膜的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线上，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、酶以及着色微球。胶体金颗粒和着色微球是通过静电吸附将抗原或抗体标记到颗粒表面，通过观察胶体金颗粒或着色微球在检测线上的聚集显色判断检测结果。而酶标记则通过催化底物显色，显示检测结果。以上标记技术都是通过显色和比色的方法来进行检测，存在依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量等缺点。传统的侧向层析产品主要是金标试纸卡。金标试纸卡是主要利用胶体金的电荷性通过静电相互作用标记抗体、层析显色的检测技术，该技术主要用于定性检测，如早早孕等产品。随着CXD图像技术的发展，胶体金发展出半定量产品，即通过T线和C线颜色的深浅进行定量检测。但这种半定量检测类似于照相比色定量技术，具有分辨率低，精确度低，误差很大的缺点。荧光标记技术具有灵敏度高、操作简单等特点，已被广泛用于生物检测领域。如DNA测序、蛋白表达分析、细胞成像、活体成像、临床诊断等。荧光微球技术是将聚苯乙烯羧基微球、荧光染料标记系统、激光技术、应用流体学及微球专用流式细胞仪等有机整合在一起的一项新技术，通过荧光微球信号来进行实验数据采集和分析，具有快速分析多重生物反应的特点及高灵敏度和特异性，可用于抗原抗体、核酸探针检测等领域的研究。通常的荧光微球多为表面荧光微球，即将荧光分子通过特定的官能团偶联到微球表面制得，表面荧光微球存在荧光较弱、均一性较差等不足。
技术实现思路
为了解决现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种实体荧光纳米微球的制备方法。本专利技术建立了一种基于近红外突光分子的聚苯乙烯材料合成突光纳米微球的方法，将近红外荧光分子偶联到苯乙烯分子上，通过聚合反应，整合到聚乙烯微球的分子内部。获得的微球属于实体突光微球，突光很强，突光均一'I"生很好。本专利技术的技术方案:一种实体荧光纳米微球的制备方法，是将羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B-苯乙烯，再由罗丹明B-苯乙烯与苯乙烯按照1:1?12的摩尔比聚合，获得实体荧光纳米微球。具体合成路线参见图1和图2。聚苯乙烯是一种无色透明的热塑性塑料，质地硬而脆，可以和多种染料混合产生不同的颜色。本专利技术所采用的荧光分子是罗丹明B，又称玫瑰红B、或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜艳桃红色的人工合成的染料，吸收波长在540nm，属于绿光区；最大发射波长在610nm，属于红光区。540nm的激发光脱离了紫外光区，能量较小，对生物体不会产生较高的背景荧光，而且与610nm的吸收波长相隔70nm的激发范围，一般的生物材料产生的荧光达不到如此高的能量激发，因此产生的背景荧光更弱。本专利技术将羧基罗丹明B分子和苯乙炔分子进行1:1加成反应，制得罗丹明B-苯乙烯，再将罗丹明B-苯乙烯和苯乙烯进行聚合反应，生成罗丹明B聚苯乙烯，再将罗丹明B聚苯乙烯制成不同粒径的纳米微球。优选地，所述的实体荧光纳米微球的制备方法，步骤如下: (1)罗丹明B的DMSO(二甲基亚砜)溶液与苯乙炔的DMSO溶液混合，混合液中加入CuCl2的水溶液，混合得反应体系，再加水，在惰性气体保护下搅拌反应2?4小时； (2)步骤(I)反应结束后，加入SDS(十二烷基磺酸钠)、CHPO (过氧化羟基二异丙苯)、TEPA (四乙烯五胺)，以及苯乙烯的DMSO溶液，惰性气体保护下搅拌反应2?4h，获得聚合物； (3)聚合物经过离心，取沉淀洗涤，干燥，得到实体荧光纳米微球。优选地，步骤(I)所述罗丹明B的DMSO溶液中罗丹明B的浓度为0.1?lmol/L ；所述苯乙炔的DMSO溶液中苯乙炔的浓度为0.1?lmol/L ;所述CuCl2的水溶液中CuCl2的浓度为 0.05 ?0.5mol/L。优选地，步骤(I)加水的量与反应体系的体积比为5?30:4。优选地，步骤(2)所述苯乙烯的DMSO溶液中苯乙烯浓度为0.5?5mol/L。优选地，所述惰性气体为氮气；步骤(2)搅拌速度为1000?5000rpm，反应温度为41 ?43°C。上述实体荧光纳米微球的制备方法中，SDS作为乳化剂，CHPO和TEPA作为氧化-还原引发剂，其加入量可根据实际需要进行调整，实现其各自功能即可，例如SDS在整个体系的终浓度为1.42?50.00g/L,CHP0在整个体系的终浓度为0.82?29.00g/L，TEPA在整个体系的终浓度为0.65?23.00g/L。由上述实体荧光纳米微球的制备方法获得的实体荧光纳米微球也在本专利技术保护范围之内。本专利技术还提供上述实体荧光纳米微球在制备荧光检测试剂中的应用。基于上述实体荧光纳米微球，可以采用侧向层析技术，制备近红外免疫层析定量试纸条，例如硝酸纤维素膜上包被检测线和质控线抗体。在检测过程中，利用荧光扫描仪，分别扫描质控线和检测线，激发荧光分子发光。荧光经滤光片过滤后，被传感器捕捉转换成电信号，经光电倍增管再转换成数字信号。将质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可获得样本中待测物的含量。该方法与荧光分子直接标记到纳米微球表面相比，属于实体荧光，荧光更强、更稳定，显著提高了检测灵敏度，降低了背景荧光强度。该方法可广泛用于食品、病毒、微生物、细胞因子、血液因子、毒品、危险化学品的快速定量检测和应用。本专利技术还提供一种荧光定量检测试剂盒，包括:由本专利技术的实体荧光纳米微球标记的检测抗体和免疫层析试纸，检测抗体能与待检测物质特异性结合；所述免疫层析试纸为固定有检测线和质控线的纤维层析材料，检测线固定有与检测抗体特异性结合的捕捉抗体，质控线固定有其他抗体，所述其他抗体能与检测抗体结合但不与待检测物质结合。上述检测试剂盒是利用夹心法检测目标分子(待检测物质)，检测时，在免疫层析试纸的检测线上固定的是与目标分子可以特异性结合的捕捉抗体，在质控线上作为参照物固定的是与目标分子和检测线固定的分子无关的其他抗体，通常为山羊抗鼠多克隆抗体。荧光微球标记的检测抗体被定量分装到0.5mL EP管底部冻干保存。当含有目标分子的样品与上样缓冲液按1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实体荧光纳米微球的制备方法，其特征在于，由羧基罗丹明B与苯乙炔共价加成得到罗丹明B‑苯乙烯，再由罗丹明B‑苯乙烯与苯乙烯按照1:1～12 的摩尔比聚合，获得实体荧光纳米微球。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑忠亮，吴琼水，蔡磊，朱辉，
申请(专利权)人：武汉纽康度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42