The invention discloses a method for developing SSR primers based on transcriptome sequencing. Based on the existing genome sequence data and its annotation, the method screened candidate SSR sites for its genomic exon sequences and designed SSR amplification primers. Then, based on the data of multiple individual transcriptome sequencing, ePCR was verified. Finally, SSR polymorphic loci were screened out and primers were amplified. The methods provided by this invention greatly reduce the development cycle and manpower of the laboratory PCR and polyacrylamide gel electrophoresis used in the past, and have greatly reduced the development cycle and development funds compared to the screening methods used in laboratory PCR and sequencing. The proposed method is not only suitable for the development of SSR primers, but also suitable for the development of all SSR primers with reference genome species, and has a wide application prospect.
【技术实现步骤摘要】
一种基于转录组测序开发SSR引物的方法
本专利技术属于SSR引物开发
,具体涉及一种开发SSR引物的新方法。
技术介绍
微卫星标记(microsatellite),又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequencerepeats),是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列,由2~6个核苷酸的串联重复片段构成,由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富,因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因,区分二倍体(或多倍体)的纯合体或杂合体,这是AFLP、RAPD等显性标记所无法做到的。另外,微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性,方便各实验室间的交流。目前,微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费。微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。同RAPD、AFLP等遗传标记不同,微卫星研究首先需要获知位点的序列信息,以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。目前已知微卫星位点的物种很有限,这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤,因此需花费一定的人力、金钱,这限制了微卫星标记的大量使用。近年来发展起来的各种微卫星位点富集技术已在一定程度上解决了这个问 ...
【技术保护点】
一种基于转录组测序开发SSR引物的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)至少采集2个不同个体的样本,分别提取总RNA并进行转录组测序文库构建;(2)转录组测序以及数据过滤;(3)每个样本单独进行转录本无参组装,得到每个个体的所有转录本;(4)基于外显子序列的SSR筛选与引物设计:从数据库下载参考基因组序列,提取所有外显子序列,并利用GMATA 2.0软件识别SSR位点,并设计引物;将得到的引物用GMATA 2.0的ePCR功能对外显子序列进行ePCR,排除专一性差的引物对;(5)SSR引物的ePCR验证:第(4)步所筛选的SSR引物用GMATA 2.0的ePCR功能对第(3)步得到每个个体的转录本分别进行ePCR,从结果中筛选引物。
【技术特征摘要】
1.一种基于转录组测序开发SSR引物的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)至少采集2个不同个体的样本,分别提取总RNA并进行转录组测序文库构建;(2)转录组测序以及数据过滤;(3)每个样本单独进行转录本无参组装,得到每个个体的所有转录本;(4)基于外显子序列的SSR筛选与引物设计:从数据库下载参考基因组序列,提取所有外显子序列,并利用GMATA2.0软件识别SSR位点,并设计引物;将得到的引物用GMATA2.0的ePCR功能对外显子序列进行ePCR,排除专一性差的引物对;(5)SSR引物的ePCR验证:第(4)步所筛选的SSR引物用GMATA2.0的ePCR功能对第(3)步得到每个个体的转录本分别进行ePCR,从结果中筛选引物。2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发SSR引物的方法,其特征在于:步骤(1)提取总RNA并进行转录组测序文库构建的具体过程如下:总RNA采用QIAGENRNeasyProtectAnimalBloodKit(73224)进行提取,并用琼脂糖凝胶电泳检查RNA的质量;转录组测序文库构建采用VAHTSTMmRNA-seqv2LibraryPrepKitfor(NR602-01)试剂盒,即每个样本取1μg总RNA,然后用多聚腺苷酸磁珠分离纯化得到mRNA,用二价阳离子在VAHTSFrag/PrimeBuffer中98℃8分钟处理进行片段化;纯化之后进行cDNA第一链和第二链合成,随后进行末端补平,dATP加端和接头连接;琼脂糖凝胶电泳选择150-200bp片段进行磁珠纯化,之后进行RCR文库扩增:98℃10s变性,60℃30s结合,72℃30s延伸,循环扩增12次;最后,对文库质量检测确认之后进行测序。3.根据权利要求1所述的基于转...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘学端,张杜,梁伊丽,胡琪,刘宏伟,郭雪,尹华群,高飞,
申请(专利权)人:中南大学,
类型:发明
国别省市:湖南,43
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