一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一株产壳聚糖酶枯草芽孢杆菌及其应用。本发明专利技术提供的枯草芽孢杆菌，其所产的壳聚糖酶产量高、酶活力强，具有与普通壳聚糖酶不同的蛋白结构，为壳聚糖酶分子机构的深入研究提供了新思路。普通的壳聚糖酶只在弱碱性至弱酸性时具有较好的活性，而本发明专利技术发现的壳聚糖酶在弱碱性、中性、弱酸性和较强酸性条件下均具有较好活性。同时，本发明专利技术发现的壳聚糖酶，不仅可作用于能够溶解的壳聚糖，还可作用于不可溶的高聚壳聚糖，省略了壳聚糖降解前的处理；反应终产物为二聚氨基葡萄糖和三聚氨基葡萄糖，成分简单，便于后续进一步加工应用，极大地节省了生产成本。

A Bacillus subtilis producing chitase and its application

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a Chitanase producing Bacillus subtilis and its application. Bacillus subtilis produced by this invention has high yield, strong enzyme activity and different protein structure from common chitin. It provides a new idea for the in-depth study of the molecular mechanism of Chitanase. The normal chitosan enzyme has good activity only when it is weak alkali to weak acidity, and the chitosan enzyme found in this invention has good activity under the condition of weak alkali, neutral, weak acid and strong acid. At the same time, the chitosan enzyme found in the invention not only can be used to dissolve the chitosan, but also can act on the insoluble polychitosan and reduce the treatment before the degradation of chitosan. The final product is two polyglucosamine and triamidosamine, and the composition is simple. It saves the cost of production.

【技术实现步骤摘要】
一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
氨基葡萄糖是重要的医药前体和化工原料,具有广泛的用途。虾蟹壳来源的壳聚糖(Chitosan)是由D-氨基葡萄糖(或少量N-乙酰-D-氨基葡萄糖)通过β-1,4-糖苷键连接形成的聚合物,全球每年产生的壳聚糖超过1000亿吨,通过水解壳聚糖可以生产大量的氨基葡萄糖。目前，常用的壳聚糖水解方法分别有：酸法水解、氧化降解、物理降解法和酶法水解。其中酶法降解壳聚糖具有环境污染低、反应条件温和、无副产物等优点，是目前应用前景最广的壳聚糖降解方法，近年来已经逐渐用于工业化生产，而酶法水解壳聚糖的关键在于壳聚糖酶。尽管酶法制备壳寡糖存在许多优势，但现有的壳聚糖酶普遍存在：适用的pH范围狭窄、只能作用于可溶解壳聚糖、降解产物多为五糖(G5)至以上的寡糖等问题。如一篇名为“微生物壳聚糖酶的研究概况”的报道中提出：现有的各类壳聚糖酶，多数为碱性蛋白，最适pH普遍集中在5～8之间，偶有几个酶的最适pH为4，但其对应的最适温度偏高，造成在实际生产应用中能耗较高、适用范围不广的情况。因此，开发一种适宜pH范围广、最适温度相对偏低、可将不可溶壳聚糖降解为二糖(G2)、三糖(G3)等低聚糖的壳聚糖酶，可有效推动海洋虾蟹来源壳聚糖的深度利用，具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌，2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:枯草芽孢杆菌，Bacillussubtilis，MY002，保藏编号为CGMCCNo.14841。相应的，一株枯草芽孢杆菌，其16SrDNA测序结果如SEQIDNO1所示；其gyrA测序结果如测序结果如SEQIDNO2所示；其gyrB测序结果如SEQIDNO3所示。相应的，所述枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用。优选的，所述应用的pH范围为2.5～7.5。优选的，所述应用的pH为：3或6。优选的，所述应用的温度范围为35～65℃。相应的，一种壳聚糖酶CsnMY002，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO4所示，其氨基酸序列如SEQIDNO5所示。相应的，所述壳聚糖酶CsnMY002在水解壳聚糖中的应用。优选的，所述应用的pH范围为：2.5～7.5。优选的，所述应用的温度为35～65℃。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术提供了一株产壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌，其所产的壳聚糖酶具有产量高、酶活力强等优点。2、本专利技术发现的壳聚糖酶，具有与普通壳聚糖酶不同的蛋白结构，其蛋白质的氨基酸序列TRDEWR片段，呈螺旋结构；而在其它壳聚糖酶中并无此段序列，相应位置为无规则的Loop结构。这为壳聚糖酶分子机构的深入研究提供了新思路。3、普通的壳聚糖酶只在弱酸至弱碱时具有较好的活性，而本专利技术发现的壳聚糖酶不仅在常规条件下活力较好，在较强的酸性条件下也具有很好的酶活力。这使得该酶的应用范围和前景远大于普通的壳聚糖酶。4、本专利技术发现的壳聚糖酶，不仅可作用于能够溶解的壳聚糖，还可作用于不可溶的高聚壳聚糖甚至未经处理的壳聚糖粗原料，省略了壳聚糖降解前的处理，极大地节省了生产成本。5、本专利技术发现的壳聚糖酶水解壳聚糖的产物主要为二聚氨基葡萄糖和三聚氨基葡萄糖,产物成分简单，便于进一步加工应用。附图说明图1为未接种菌株的水解圈空白对照；图2为筛选菌株在选择培养基上形成的透明水解圈；图3为D-葡萄糖盐酸盐标准曲线图；图4为菌株MY002的16SrDNA系统进化树；图5为菌株MY002的gyrA系统进化树；图6为菌株MY002的gyrB系统进化树；图7为去信号肽的壳聚糖酶凝胶过滤层析结果；图8为壳聚糖酶CsnMY002在不同温度下作用效果对比图；图9为壳聚糖酶CsnMY002在不同pH下作用效果对比图；图10为壳聚糖酶CsnMY002水解胶体壳聚糖产物分析；图11为壳聚糖酶CsnMY002水解不可溶高聚壳聚糖产物分析。具体实施方式实施例1：产壳聚糖酶菌株的筛选1、材料准备：(1)土壤样品：从绵阳芦笋种植区采集土样。(2)培养基：1)壳聚糖酶筛选培养基(g/L)：胶体壳聚糖2.0，K2HPO40.7，KH2PO40.3，(NH4)2SO45,MgSO4﹒7H2O0.5，FeSO4﹒7H200.01，琼脂12.0，pH＝7.0；2)肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0,NaCl5.0,pH＝7.0。3)壳聚糖酶诱导培养基(g/L)：胶体壳聚糖5.0，K2HPO40.7，KH2PO40.3，(NH4)2SO41.0,MgSO4﹒7H2O0.5，FeSO4﹒7H200.01，pH＝7.0；4)LB培养基(g/L):蛋白胨10.0，酵母抽提物5.0，NaCl10.0。(3)试剂：1)胶体壳聚糖:称取高聚细粉壳聚糖10g,加入适量浓盐酸,并在磁力搅拌器上搅拌4～6h使其充分溶解,再用去离子水反复清洗离心(4000r/min)，最后形成胶状物后一边搅拌一般缓慢地加入NaOH调节pH至中性，即得到胶体壳聚糖，于4℃保存备用。2)3,5-二硝基水杨酸(DNS):取50ml的蒸馏水在80℃的水浴锅中加热，待加热之后加入26.2ml的2mol/LNaOH和0.63g的3，5-二硝基水杨酸，待搅拌溶解后加入18.2g的酒石酸钾钠，搅拌溶解后再加入0.5g结晶苯酚和0.5gNa2SO3，搅拌溶解，待冷却之后用蒸馏水定容至100ml，贮存于棕色瓶中，4℃保存备用。(4)试剂盒、酶及细胞1)BamHI、SalI购买于NewEnglandBiolabs,Inc.；2)质粒抽提试剂盒购买于北京全式金生物技术有限公司；3)T4连接酶购买于TakaraBio.Inc.；4)感受态细胞DH5α和大肠杆菌BL21为本实验室保存。2、菌株初筛(1)称取5g土样放入盛有45ml蒸馏水的锥形瓶(250m)中,搅拌溶解，煮沸30min，然后取上清液进行梯度稀释(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5共5个浓度)，各取100ul分别涂布于壳聚糖酶筛选培养基中(每个梯度设置2个平行)，置于37℃恒温培养箱中培养2～4d。(2)挑取在选择培养平板上生长且周围有明显透明水解圈的菌落，划线接种于新的选择培养平板上，置于37℃恒温培养箱中培养2d，再挑菌落划线接种，如此进行3代筛选，以保证得到纯种菌株。(3)经连续3代分纯后挑取单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基中液体培养，然后取5ul加在直径为6mm滤纸片上，滤纸片置于选择培养基上，37℃恒温培养2d，水解圈如图1、2所示。测量透明圈的大小，如表1所示。表1筛选菌株产生水解圈的大小(4)将分纯，且能产生透明水解圈的菌株进行保种，并于-80℃下贮存。3、菌株复筛及壳聚糖酶酶活测定(1)绘制5umol/LD-葡萄糖盐酸盐标准曲线取30支200ul的离心管，均匀分为等量的3组，如表2所示，分别加入5μmol/ml的D-葡萄糖盐酸盐标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配制成不同含量的D-葡萄糖盐酸盐标准反应液。将各个离心管摇匀，置于沸水浴中准确加热5min显色，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:枯草芽孢杆菌，Bacillus subtilis，MY002，保藏编号为CGMCC No.14841。

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:枯草芽孢杆菌，Bacillussubtilis，MY002，保藏编号为CGMCCNo.14841。2.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：其16SrDNA测序结果如SEQIDNO1所示；其gyrA测序结果如测序结果如SEQIDNO2所示；其gyrB测序结果如SEQIDNO3所示。3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用。4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌在水解壳聚糖中的应用，其特征在于：所述应用的pH范围为：2.5～7.5。5.如权利要求3所述的枯草芽孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚刚，苟艳，谢天，刘忠川，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51