一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法技术

本发明专利技术属于分子印迹聚合物技术领域，特别是一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。本发明专利技术的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。本发明专利技术技术方案为：一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法，将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后，对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。本发明专利技术具有以下特点：本发明专利技术丙烯酰胺类单体带有金属螯合能力。本发明专利技术分子印迹水凝胶具有温度和pH双重敏感性；本发明专利技术采用反相悬浮技术；本发明专利技术为水凝胶聚合物。

Preparation method of protein affinity imprinted hydrogel polymer based on acrylamide group metal chelating monomer

The invention belongs to the field of molecular imprinting polymer technology, in particular a preparation method of a protein affinity imprinted hydrogel polymer based on the acroleyl group metal chelate monomer. The aim of the present invention is to provide a preparation method for the protein affinity imprinted hydrogel polymer based on the acroleyl group metal chelating monomer, aiming at the above technical analysis and existing problems. The technical scheme of the invention is: a preparation method of a protein affinity imprinted hydrogel polymer based on an acrylamide group metal chelate monomer. After chelating the acrylamide monomer with the two valence metal ions, the polymer is obtained by specific adsorption and removal of the target protein after the removal of the target protein. The invention has the following characteristics: the acrylamide monomer of the invention has metal chelating capacity. The molecularly imprinted hydrogel has dual sensitivity of temperature and pH; the invention adopts an inverse suspension technology; the invention is a hydrogel polymer.

【技术实现步骤摘要】
一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法
本专利技术属于分子印迹聚合物
，特别是一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。技术背景分子印迹技术是指制备对某一结构特定分子(通常称为模板分子或印迹分子)具有选择性识别能力的聚合物的技术,制备获得的聚合物称为分子印迹聚合物，简称MIP。MIP是一种高化学和pH稳定性的聚合物，能够承受高温、高压和苛刻的酸碱条件，使用寿命长，制备简单，并且在三维空间上与模板分子结构匹配的空穴和与功能单体能形成的特定识别位点（催化或氢键）。分子印迹聚合物因其优良选择性识别能力，目前已经成功应用在色谱分离、固相萃取、固相微萃取、抗体和受体模拟物、生物传感器等诸多领域，显示出广阔的发展前景。但是由于一系列的限制,目前分子印迹材料的研究和开发一般都是以小分子物质如氨基酸、金属离子、小分子有机物，药物等作为模板分子，而在大分子上的应用相对较少，这就限制了分子印迹技术在生物活性物质如核酸、蛋白、酶方面的应用。分子印迹技术在生物大分子尤其是蛋白质上的应用仍是具有一定难度的领域。首先在功能单体与模板蛋白连接方式上，常用功能单体与模板蛋白直接通过微弱的氢键形成复合物，这种基于氢键形成的位点的作用力极弱，在水相条件很容易受到水的竞争，从而导致吸附容量下降。（1）作为改进，Kempe等用表面印迹法制备了分离蛋白质的选择性吸附剂，但是1、该研究以甲基丙烯酸为单体，在Cu2+和核糖核酸酶存在下，核糖核酸酶表面的组氨酸能与金属离子进行螯合，暴露在组氨酸残基表面的咪唑基能够与金属螯合单体结合。2、该研究是表面印迹法，表面印迹法虽能使大分子自由进出键合位点,使表面成为印迹蛋白质的特异性目标位点，但表面印迹需要以通过复杂的制备步骤先获得载体材料，进而以载体材料为支撑进行表面分子印迹反应，该方法制备过程繁琐，成本较高，不适于大规模产业化和应用。3、该研究的铜离子是以离子交换的形式与聚合物上的羧酸基结合，离子交换作用力较弱，离子交换容量很低，容易受到缓冲体系下其他一价阳离子的竞争而流失，降低蛋白质的吸附容量。其次在引发方式上，对于蛋白分子印迹，其结构特点限制了印迹后需要保留分子自身的生物活性，而蛋白分子对温度和有机溶剂比较敏感，一般分子印迹是以有机溶剂作为反应体系，合成中通常加热引发聚合，导致蛋白二级结构会发生变化，从而失去活性。另外，传统分子印迹聚合物需要依靠高交联度来保持其印迹结构的刚性，所制备的是高度交联的聚合物，但交联度过高不仅使得分子印迹聚合物的外部形态松散易碎，还导致聚合物中模板分子的传质过程缓慢，吸附和脱附困难，残留的模板分子在使用过程中发生缓慢脱吸附。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种基于丙烯酰族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法。本专利技术技术方案为：一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法，其特征在于，将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后，对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。进一步的，包括以下步骤：S1取甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与0.5摩尔比亚氨基二乙酸或氨基三乙酸并搅拌混合，加入无水氢氧化钾进行反应，所述无水氢氧化钾与以上混合物摩尔比为（0.04-0.06）：1，缓慢升高温度到60-80℃，反应3-6小时，减压蒸馏除去未反应完全的试剂和反应产物乙醇，调节pH至碱性，加入氯仿，摇晃后静置分层，去上层水溶液，减压干燥，得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体；S2在水相介质中，加入上述步骤制备丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体，并引入0.1-0.3摩尔比的一种或多种二价金属离子，搅拌30-120min进行螯合反应，所述的单体和二价金属离子形成稳定的八面体络合结构；S3引入占单体5-25%质量比的蛋白模板分子，使金属螯合单体与蛋白模板分子形成稳定复合物；S4加入一种或多种可与丙烯酰胺族单体共聚形成凝胶态聚合物的交联剂及引发剂和乳化剂吐温80，交联剂用量为单体物质的量的30-50％，引发剂用量为单体重量的1.3～12％，乳化剂用量为单体重量的0.2～2.5％；S5将上述水相溶液加入由三氯甲烷、正己烷、司盘80组成的反相悬浮介质，所述水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为（25~40）：（20~40）：（1~5）：（15~25），通过100-15000转/分钟的搅拌速度搅拌使体系内形成粒径0.1-1000微米的油包水性乳液液滴，待悬浮液滴粒径稳定后，通入氮气；S6通过加热方式引发或者紫外辐照方式引发使单体与交联剂共聚形成具有亲和印迹水凝胶聚合物。S7使用乙腈、N，N'-二甲基甲酰胺、竞争络合剂中的一种，使蛋白模板分子从亲和印迹水凝胶聚合物上移除，即可得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。进一步的，S1中所述甲基丙烯酸酯类为甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸丁酯中的一种；所述丙烯酸酯类为丙烯酸甲酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸丙酯中的一种；丙烯酰氯类包括甲基丙烯酰氯。进一步的，S1为在配有搅拌桨，温度计，冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中，加入200ml三氯甲烷，50g甲基丙烯酸乙酯和0.5摩尔比亚氨基二乙酸并搅拌混合，加入1.8g无水氢氧化钾进行反应，缓慢升高温度到80℃，该温度下反应3小时后，减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酸乙酯和反应产物乙醇，然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10，加入100ml的氯仿，摇晃后静置分层，去上层水溶液，旋转蒸发仪上减压干燥，得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基二乙酸钠。进一步的，S1为在配有搅拌桨，温度计，冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中，加入200ml三氯甲烷，100g甲基丙烯酰氯和0.5摩尔比氨基三乙酸并搅拌混合，加入5g无水氢氧化钾进行反应，缓慢升高温度到60℃，该温度下反应6小时后，减压蒸馏除去未反应完全的甲基丙烯酰氯和反应产物乙醇，然后滴加1mol/l的NaOH调节pH至10，加入180ml的氯仿，摇晃后静置分层，去上层水溶液，旋转蒸发仪上减压干燥，得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体甲基丙烯酸基氨基三乙酸钠。进一步的，S2中二价金属离子为Fe2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+中的一种或多种。进一步的，S2中二价金属离子用量为10-50mmol。进一步的，S3中蛋白模板分子为牛血清白蛋白，溶菌酶，核糖核酸酶，血红蛋白中的一种或多种。进一步的，S4中所述的交联剂为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，N，N′-亚苯基双丙烯酰胺，二丙烯酰胺基苯甲酸中的一种或多种的混合；所述水溶性引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾；所述水溶性偶氮引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐，偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐,偶氮二氰基戊酸，偶氮二异丙基咪唑啉中的一种或多种的混合。进一步的，S6中加热方式引发的加热温度为40-70℃，聚合时间2-24小时。进一步的，S7将所制备的蛋白印迹亲和印迹水凝胶用100ml丙酮淋洗三次，每次淋洗后用100ml蒸馏水冲洗；分别在50ml乙酸和50ml4%十二烷基磺酸钠水溶液中各浸泡2h后弃去溶液，并用蒸馏水反复冲洗至中性，滤干；进而在150mLpH＝7.5、含有0.05mol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法，其特征在于，将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后，对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。

【技术特征摘要】
1.一种基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物的制备方法，其特征在于，将丙烯酰胺族单体与二价金属离子螯合后，对目标蛋白进行特异性吸附结合、移除后得到的聚合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1取甲基丙烯酸酯类、丙烯酸酯类、丙烯酰氯类中的一种与0.5摩尔比亚氨基二乙酸或氨基三乙酸并搅拌混合，加入无水氢氧化钾进行反应，所述无水氢氧化钾与以上混合物摩尔比为（0.04-0.06）：1，缓慢升高温度到60-80℃，反应3-6小时，减压蒸馏除去未反应完全的试剂和反应产物乙醇，调节pH至碱性，加入氯仿，摇晃后静置分层，去上层水溶液，减压干燥，得到丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体；S2在水相介质中，加入上述步骤制备丙烯酰胺族可与金属离子螯合的单体，并引入0.1-0.3摩尔比的一种或多种二价金属离子，搅拌30-120min进行螯合反应，所述的单体和二价金属离子形成稳定的八面体络合结构；S3引入占单体5-25%质量比的蛋白模板分子，使金属螯合单体与蛋白模板分子形成稳定复合物；S4加入一种或多种可与丙烯酰胺族单体共聚形成凝胶态聚合物的交联剂及引发剂和乳化剂吐温80，所述交联剂用量为单体物质的量的30-50％，所述引发剂用量为单体重量的1.3～12％，所述乳化剂用量为单体重量的0.2～2.5％；S5将上述水相溶液加入由三氯甲烷、正己烷、司盘80组成的反相悬浮介质，所述水相溶液、三氯甲烷、正己烷、司盘80的体积比为（25~40）：（20~40）：（1~5）：（15~25），通过100-15000转/分钟的搅拌速度搅拌使体系内形成粒径0.1-1000微米的油包水性乳液液滴，待悬浮液滴粒径稳定后，通入氮气；S6通过加热方式引发或者紫外辐照方式引发使单体与交联剂共聚形成具有亲和印迹水凝胶聚合物；S7使用乙腈、N，N'-二甲基甲酰胺、竞争络合剂中的一种，使蛋白模板分子从亲和印迹水凝胶聚合物上移除，即可得到基于丙烯酰胺族金属螯合单体的蛋白亲和印迹水凝胶聚合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中所述甲基丙烯酸酯类为甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸丁酯中的一种；所述丙烯酸酯类为丙烯酸甲酯，丙烯酸乙酯，丙烯酸丙酯中的一种；丙烯酰氯类包括甲基丙烯酰氯。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1为在配有搅拌桨，温度计，冷凝管和加料口的四口圆底烧瓶中，加入200ml三氯甲烷，50g甲基丙烯酸乙酯和0.5摩尔比亚氨基二乙酸并搅拌混合，加入1.8g无水氢氧化钾进行反应，缓慢升高温度到80℃，该温度下反应3小时后，减压蒸馏除去未反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉众，
申请(专利权)人：南京百赛生物色谱技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32