多特异性结合蛋白制造技术

本发明专利技术一般地涉及多特异性结合蛋白，并涉及制备和使用这种蛋白质的方法。还公开了包含这类蛋白的药物组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多特异性结合蛋白专利技术
本专利技术一般地涉及多特异性结合蛋白。本专利技术还涉及制备和使用这种蛋白质的方法。还公开了包含这类蛋白的药物组合物和试剂盒。专利技术背景单克隆抗体作为一种单一疗法已被成功地应用于治疗各种疾病，包含癌症和免疫性疾病。他们特异性结合靶点的能力在医学上具有一定的先进性。但是，在一些治疗中，能调控多个靶点也是有益的。与单克隆抗体分子相比，能够结合多个靶蛋白或靶蛋白上不同抗原表位的生物学分子或许会提供额外的益处。很多针对与多于靶点结合的生物结构的设计已经提出，但开发多特异性生物分子仍然具有挑战性。产生双特异性分子最常用的方法是通过多肽接头进行抗体片段的基因融合。基于IgG的对称特性，抗体结构域融合的双特异性分子在性质上是二价的。但是，在某些情况下，二价会导致不必要的拮抗活性。多聚化结构域，如亮氨酸拉链，已被用来促使两个结合特异性分子成为单一分子。虽然接头在双特异性分子工程中具有优势，但他们也可能在治疗设置中产生问题。实际上，这些外源多肽可能会引起对接头自身或蛋白质和接头间连接的免疫应答。这种结构在体内的稳定性可能降低和/或可能难以表达，导致缺乏同质性或产生部分氨基酸链。生成两个不同重链异型二聚体的策略已经被设计出来。但是，由于形成大量不需要的单一重链同型二聚体或轻链的错配，这些策略受到了束缚。多特异性结构的其它困难还包含功能性的降低，例如降低了对靶标的亲和力。因此综上所述，双特异性生物分子的设计和开发具有很多挑战，同时对于具有足够的药理特性及可被有效生产的多特异性结合蛋白存在需求。因此，本专利技术的目的是提供具有良好生物物理和/或药理学特性的多特异性结合蛋白。本专利技术的另目的是多特异性结合蛋白，其可以高水平同质性和/或完整性产生。本专利技术的另目的是提供多特异性结合蛋白，其能够能够在例如哺乳动物细胞中有效地产生。本专利技术的另目的是提供维持其结合部分功能的多特异性结合蛋白本专利技术的另目的是提供在结合部分的选择中允许灵活性的多特异性结合蛋白。本专利技术的另目的是提供可以避免不需要的免疫应答的多特异性结合蛋白。本专利技术的另目的是提供具有良好的可展性如稳定性的多特异性结合蛋白。本专利技术的进一步目的包含上述任何目的的组合。专利技术概述本专利技术解决了上述需求，并提供包含至少两个特异性针对两个不同抗原表位的结合单元的蛋白。一方面，本专利技术的蛋白包含形成特异性针对第一抗原表位的第一结合单元的第一重链和第一轻链，及形成特异性针对第二抗原表位的第二结合单元的第二重链和第二轻链。一方面，第一重链和所述第二重链各包含一个或多个氨基酸的变化，其减少了重链之一的同型二聚体的形成。一方面，这些氨基酸变化是第一重链中在位置366的酪氨酸(Y)[T366Y,EU编号(Edelmanetal,ProcNatlAcadSciUSA.1969May；63(1):78-85)和第二重链中在位置407的苏氨酸(T)[Y407T,EU编号]。一方面，这些氨基酸变化是第一重链中在位置366的色氨酸(W)[T366W]和第二重链中在位置366的丝氨酸(S)[T366S]，在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。一方面，重链是来自IgG1或IgG4重链的重链。一方面，第一重链除了包含在位置366的色氨酸(W)[T366W]外，还包含在位置354的半胱氨酸(C)[S354C]，而第二重链除了包含在位置366的丝氨酸(S)[T366S]，在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]外，还包含在位置349的半胱氨酸(C)[Y349C]。一方面，重链来自IgG4重链的重链。在两条重链中引入这些氨基酸变化有利于两条重链的异二聚化并最小化同型二聚体的形成。根据生物信息学评估，这些氨基酸变化还具有低免疫原性(DeGrootetal.TrendsImmunol.2007Nov；28(11):482.)。一方面，本专利技术中蛋白的第一重链或第二重链还包含一个或多个氨基酸变化，其减少重链与金黄色葡萄球菌蛋白A(staphylococcalProteinA)的结合。一方面，这些氨基酸变化是重链之一在位置435的精氨酸[H435R,EU编号]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F,EU编号]。这两种突变位于CH3结构域，并并入重链之一从而减少和蛋白A的结合。这两个变化有利于在蛋白纯化时去除重链同型二聚体及其它杂质。一方面，本专利技术的蛋白的重链包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]，还包含在位置407的苏氨酸(T)[Y407T]。一方面，本专利技术中的蛋白的重链包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]，还包含在位置366的丝氨酸(S)[T366S]，在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]。另一方面，在本专利技术的蛋白中，第一和第二重链通过一个或多个二硫桥形成异型二聚体。另一方面，在本专利技术的蛋白中，结合单元之一中的重链和轻链通过接头共价连接。一方面，两个结合单元中的重链和轻链分别通过接头共价连接。这避免了蛋白表达和纯化时轻链的错配，并在不影响功能性和/或结合单元的结合亲和力的情况下允许本专利技术中的蛋白可以使用更多种类的轻链。一方面，本专利技术的蛋白中使用的接头包含26到42个氨基酸，例如30到40个氨基酸。另一方面，本专利技术的蛋白中使用的接头包含34到40个氨基酸，例如36到39个氨基酸，例如38个氨基酸。因此，一方面，本专利技术提供蛋白，其包含第一氨基酸链和第二氨基酸链，其中第一链包含与接头共价连接的第一轻链，其自身与第一重链共价连接，其中第二链包含与接头共价连接的第二轻链，其自身与第二重链共价连接。一方面，从N端开始，第一链包含轻链可变区、轻链恒定区，接头、重链可变区和重链恒定区。一方面，从N端开始，第二链包含轻链可变区、轻链恒定区、接头、重链可变区和重链恒定区。一方面，第一和第二链均从N端开始包含轻链可变区、轻链恒定区、接头、重链可变区和重链恒定区。由此产生的蛋白具有完整的Fc，比IgG稍大，并且具有两个独立的结合位点，例如各针对一个靶蛋白或各针对同一靶蛋白上的抗原表位。这种形式大大减少了表达和纯化后的异质性，维持了结合区域的功能特性。这也使得同源蛋白能够表达，例如在哺乳动物细胞中表达良好。本专利技术的蛋白质具有可接受的免疫原性概貌，并且在体外和体内都具有令人满意的稳定性。本专利技术还公开了编码本专利技术中蛋白的氨基酸序列的核酸序列和DNA分子。本专利技术还公开了载体，例如包含这种核酸序列和DNA分子的表达载体，以及包含这种载体的细胞。本专利技术还公开了生产本专利技术中蛋白的方法和使用这种蛋白的方法，例如治疗方法。本专利技术的蛋白在治疗或预防疾病或病症的方法中有用，如本文所述。治疗或预防的疾病或病症将取决于结合单元的特异性，即被本专利技术中蛋白的结合单元所识别的靶蛋白。因此，本专利技术还提供了一种治疗疾病或病症的方法，包括给患者施用本专利技术的蛋白。本专利技术还提供了本专利技术的蛋白用于医学的用途，例如用于治疗或预防哺乳动物、特别是人类的疾病或病症。因此，在一个实施方案中,本专利技术提供了一种蛋白，包含：a)第一重链和第一轻链，其形成特异性针对第一抗原表位的第一结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，包含:a)第一重链和第一轻链，其形成特异性针对第一抗原表位的第一结合单元，和b)第二重链和第二轻链，其形成特异性针对第二抗原表位的第二结合单元,其中所述第一重链包含在位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，其中所述第二重链包含在位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，且其中所述第一或所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]，或其中所述第一重链包含在位置366的色氨酸(W)[T366W]，其中所述第二重链包含在位置366的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，且其中所述第一或所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 US 62/186,4231.一种蛋白，包含:a)第一重链和第一轻链，其形成特异性针对第一抗原表位的第一结合单元，和b)第二重链和第二轻链，其形成特异性针对第二抗原表位的第二结合单元,其中所述第一重链包含在位置366的酪氨酸(Y)[T366Y]，其中所述第二重链包含在位置407的苏氨酸(T)[Y407T]，且其中所述第一或所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]，或其中所述第一重链包含在位置366的色氨酸(W)[T366W]，其中所述第二重链包含在位置366的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，且其中所述第一或所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]。2.权利要求1的蛋白，其中所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]。3.根据权利要求1或2所述的蛋白，其中所述第一和所述第二重链还包含YTE突变(M252Y/S254T/T256E)。4.权利要求1至3任一项的蛋白，其中所述第一重链包含在位置366的色氨酸(W)[T366W]，其中所述第二重链包含在位置366的丝氨酸(S)[T366S]、在位置368的丙氨酸(A)[L368A]和在位置407的缬氨酸(V)[Y407V]，其中所述第二重链还包含在位置435的精氨酸[H435R]和在位置436的苯丙氨酸[Y436F]，且其中所述重链来自IgG1或IgG4的重链。5.权利要求1至4任一项的蛋白，其中所述第一重链包含氨基酸序列SEQIDNO:1、4、36或37。6.权利要求1至4任一项的蛋白，其中所述第二重链包含氨基酸序列SEQIDNO:3、5、38或39。7.权利要求1至6任一项的蛋白，其中所述第一重链包含氨基酸序列SEQIDNO:1或4，而其中所述第二重链包含氨基酸序列SEQIDNO:3或5。8.权利要求1至6任一项的蛋白，其中所述第一重链包含氨基酸序列SEQIDNO:36和/或其中所述第二重链包含氨基酸序列SEQIDNO:38。9.权利要求1至6任一项的蛋白，其中所述第一重链包含氨基酸序列SEQIDNO:37和/或其中所述第二重链包含氨基酸序列SEQIDNO:39。10.权利要求1至9任一项的蛋白，其中所述第一或第二轻链包含氨基酸序列SEQIDNO:2或35。11.权利要求1至10任一项的蛋白，其中所述第一重链和所述第一轻链通过第一接头共价连接。12.权利要求1至10任一项的蛋白，其中所述第二重链和所述第二轻链通过第二接头共价连接。13.权利要求1至10任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·加内桑，S·辛格，A·沙班，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰国际有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE