本发明专利技术涉及一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参(Isostichopus badionotus)的方法，以及一组单独或组合使用时，可用来鉴别美国肉参的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白虽然发现有部分和植物或细菌等物种和其一致，但对比梅花参、海地瓜、刺参、墨西哥参时，所述特征多肽是美国肉参独有的。
【技术实现步骤摘要】
一种使用来源于热休克蛋白GP96的特征多肽鉴别美国肉参的方法本申请是中国专利技术申请“CN201610410893.6，一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参的方法”的分案申请。
本专利技术属于生物
，具体而言，涉及一种使用专属性肽段组鉴别美国肉参(Isostichopusbadionotus)的方法。
技术介绍
海参富含酸性黏多糖，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。故此，海参享有“营养宝库”之美誉，现代人把海参誉为“海味八珍之首”。市场上海参种类繁多，不同海参因其营养价值、口感等不同而价格相差巨大。美国肉参是海参的一种，自然生长在冷水海域中，其生长期较长，一般为7-10年，故营养价值极高，除具一般海参拥有的富含蛋白质和多种微量元素的优点外，还具有参体肥壮，发涨率高，参肉厚实，口感爽滑等特点。是烹饪和药用俱佳的极品。不同品种的海参相比较，有的粘多糖含量高，对心脑血管有好处；有的皂甙含量高，对抗癌有益。海参同人参一样，如果皂甙含量高，则药用价值高，但可能味道不好；而有的海参蛋白质含量高，如茄参和刺参，可以大量用在宾馆和家庭餐桌上，对蛋白质缺乏、营养不良的人群提供身体所需的营养物质。由于目前缺乏特别有效的识别海参品种的方法，鉴别海参种类的方法还只是靠传统的外观观察，缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定海参的方法。
技术实现思路
本专利技术对美国肉参(Isostichopusbadionotus)的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对美国肉参进行鉴别的技术，填补了国内外海参鉴别的空白。本专利技术首先涉及一组单独或组合使用时，可用来鉴别美国肉参的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的蛋白为美国肉参中的如下蛋白：(1)actinisoform2、histoneH2B和glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase蛋白；(2)argininekinase、translationallycontrolledtumorprotein和majoryolkprotein2蛋白；(3)heat-shockprotein70和heat-shockproteingp96蛋白；(4)tropomyosin蛋白。优选的，所述来源于actinisoform2、histoneH2B和glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.1：EIAALAPPTMK；SEQIDNO.2：LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK；SEQIDNO.3：CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK；SEQIDNO.4：ETYSIYIYK；SEQIDNO.5：AGIALSENFVK；SEQIDNO.6：VPVPDVSVVDLTLR。上述肽段1-6的m/z分别为：571.3；876.1；1069.5；393.9；574.8；754.9。优选的，所述来源于argininekinase、translationallycontrolledtumorprotein和majoryolkprotein2蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.7：PYDDVLDPAYVISSR；SEQIDNO.8：IMDDVLDPAYVISSR；SEQIDNO.9：DVITGEELFSDSYK；SEQIDNO.10：LVDDLYWR；SEQIDNO.11：IGSVFESLNR；SEQIDNO.12：PVVFLNPER。上述肽段7-12的m/z分别为：855.4；565.3；801.9；540.3；561.3；535.8。优选的，所述来源于heat-shockprotein70和heat-shockproteingp96蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.13：DAGVIAGLQVLR；SEQIDNO.14：SEIHELVLVGGSTR；SEQIDNO.15：VEIESFFDGEDFSETLTR；SEQIDNO.16：DDLVNNLGTIAK；SEQIDNO.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK；SEQIDNO.18：YSQFINFPIYLWGSK。上述肽段13-18的m/z分别为：606.4；748.9；1061.0；636.8；1028.0；932.0。优选的，所述来源于tropomyosin蛋白的特征多肽，其序列为：SEQIDNO.19：MSELESQVTSSK；SEQIDNO.20：MSELESQVMGSK；SEQIDNO.21：QLESELDDTSEK；SEQIDNO.22：YDDIEQSSEESER；SEQIDNO.23：YNDIEQSSEESER。上述肽段19-23的m/z分别为：442.5；442.5；465.2；529.6；529.2。本专利技术还涉及一种检测美国肉参的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的美国肉参成分。所述的质谱前处理步骤如下：(1)称取1g海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200ul转移到1mlEP管中；(2)取2μL1mol/LDTT加入到100μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；(3)取10μL现配的1mol/L的IAA(配置过程需避光，现用现配)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；(4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层，转移至新的EP管中；(5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；(6)取5ulTrypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；(7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。所述的质谱法检测为，采用ABSCIEX5600检测，流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.25mL/min，TOF扫描范围：350-1500Da，正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，CurtainGas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10。采用ABSCIEX三重四级杆检测，流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.3mL/min，电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。所述的分析样本中的美国肉参成分为，将待测样品的质谱结果对比所述美国肉参蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)的标准质谱谱图，出现所述美国肉参蛋白的低同源性多肽片段的质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为美国肉参样本。优选的，所述的美国肉参蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)为SEQIDNO.1～23所示的各条特异性多肽。本专利技术还涉及使用上述美国肉参本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组通过单独使用或任意组合使用对美国肉参(Isostichopus badionotus)进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的美国肉参蛋白为heat‑shock protein gp96蛋白；来源于heat‑shock protein gp96蛋白的特征多肽的序列为：SEQ ID NO.16：DDLVNNLGTIAK；SEQ ID NO.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK；SEQ ID NO.18：YSQFINFPIYLWGSK。
【技术特征摘要】
1.一组通过单独使用或任意组合使用对美国肉参(Isostichopusbadionotus)进行鉴别的特征多肽，所述特征多肽为美国肉参蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指该肽段为美国肉参独有的，且长度在5～30个氨基酸的多肽片段，所述的美国肉参蛋白为heat-shockproteingp96蛋白；来源于heat-shockproteingp96蛋白的特征多肽的序列为：SEQIDNO.16：DDLVNNLGTIAK；SEQIDNO.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK；SEQIDNO.18：YSQFINFPIYLWGSK。2.根据权利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述的SEQIDNO.16～18的多肽片段的m/z依次分别为：636.8；1028.0；932.0。3.一种检测美国肉参的方法，所述方法包括如下步骤：(1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液；(2)通过质谱法检验待测样本的多肽成分，分析样本中的刺参成分。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理步骤如下：(1)称取海参样品均质成粉末状态，加入蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心，取上清液转移到EP管中；(2)取DTT加入到上述蛋白溶液中，37℃反应1小时；(3)取现配的IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；(4)采用10K滤膜超滤30分钟，使用碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层，转移至新的EP管中；(5)再加入碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；(6)取Trypsin酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37℃酶解16-18小时；(7)采用10K滤膜超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为：采...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓梅，张鸿伟，崔淑华，王颖，徐彪，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37
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