本发明专利技术公开了一种食管癌相关的MAGE-A4和NY-ESO-1蛋白表达的长度为9个氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列见序列表中的序列1至序列6中的任意一个。本发明专利技术还提供了这些抗原肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这些肽段单独或形成的复合物可以诱导针对食管癌的特异性的CTL。这种复合物可用于制备治疗食管癌的治疗性疫苗。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种食管癌相关的MAGE-A4和NY-ES0-1蛋白表达的长度为9个氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列见序列表中的序列1至序列6中的任意一个。本专利技术还提供了这些抗原肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这些肽段单独或形成的复合物可以诱导针对食管癌的特异性的CTL。这种复合物可用于制备治疗食管癌的治疗性疫苗。【专利说明】食管癌相关肽和热休克蛋白形成的复合物及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及食管癌抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78 的复合物以及它们抗食管癌的用途。
技术介绍
食管癌在我国每年发病和死亡人数都占全球人数一半以上，是最具中国特色的恶 性肿瘤之一，年发病率超过22/10 5。在我国，食管癌以食管鳞癌为主，占95%以上。由于食 管癌早期症状不典型，50%的患者在诊断时已为晚期。食管癌手术后仍有近90%的患者术 后复发转移，术后5年生存率仅维持在30%左右，年死亡率超过16/10 5。 化疗是常规治疗手段,然而食管癌对目前的化疗药物多为中度或低度敏感,加之 食管癌多数为分化程度差异较大的鳞癌细胞，以及抗药性存在等因素，使食管癌化疗效果 较难提高。标准治疗方案顺钼联合5-FU的方案完全缓解也是很少见的，中位缓解时间通常 很短。 近年来，靶向治疗已成为肿瘤治疗热点。然而由于肿瘤差异性比较大，靶向药物的 疗效不均一，同时，靶向药物还存在耐药性的问题，且食管癌发生地多为贫穷地区，靶向药 物的昂贵费用也让患者望而却步。 近年来，免疫治疗作为第四大肿瘤治疗模式已成研究热点。在临床上食管鳞癌组 织中检测到gp96的高表达，表达水平和肿瘤预后呈正相关。小鼠成瘤实验中也证实在已成 形的鳞状食管癌细胞系瘤体中注射自体gp96可以明显减慢肿瘤的生长，gp96可以激起更 强的肿瘤特异性杀伤。我们的临床试验也表明食管癌患者皮下免疫自体肿瘤gp96复合物 可以增强患者肿瘤特异性的CTL反应。因此，热休克蛋白gp96治疗食管癌极有可能取得非 常好的疗效。 gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔（Endoplasmic Reticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表 达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可增加其表达。在细胞内gp96作为分子 伴侣蛋白，可阻止蛋白质聚集，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，抑制错折叠蛋白质的分 泌。gp96分子具有多肽结合的能力，能结合5-25个氨基酸的多肽序列。热休克蛋白HSP78 是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各 种短肽结合。 在细胞外，gp96可作为呈递分子将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性 和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应。因此HSP本身不具备抗原性，所结合的短肽决定 了复合物的抗原性。gp96还可以活化树突细胞（DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共 刺激因子的表达，从而提高免疫反应。 目前已证实gp96和hsp78分子可以结合多种结合抗原多肽，包括泡状口炎病毒 抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒 抗原肽等。但目前为止未见从食管癌患者肿瘤组织中分离鉴定与HSP结合的抗原多肽。 食管癌是严重的消化系统恶性肿瘤。前期的动物试验和临床试验显示，自体gp96 治疗食管癌应该会有不错的效果。然而，由于食管解剖结构的特殊性，组织大小是限于这种 治疗方法应用的一个关键，同时疫苗制备具有一次性的特点，能够完成有效疗程的患者有 限，gp96免疫治疗食管癌仍存在很多不足。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题是筛选能激活食管癌特异性T细胞的肽段。克服 肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，能够在健康个体及食管癌患者中诱导产生特异性细 胞毒性T淋巴细胞（杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗食管癌作用，对正常细胞 及组织无破坏作用。 本专利技术的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的食管癌抗原的复合物。所述 的食管癌抗原可以分别是食管癌肿瘤抗原MAGE-A4蛋白上第49-57位的氨基酸序列，其序 列可以是GTLEEVPAA，或其变异序列；食管癌肿瘤抗原MAGE-A4蛋白上第24-32位的氨基酸 序列，其序列可以是GLVGAQAPT，或其变异序列；食管癌肿瘤抗原MAGE-A4蛋白上第202-210 位的氨基酸序列，其序列可以是LLIIVLGTI，或其变异序列；食管癌肿瘤抗原MAGE-A4蛋 白上第46-54位的氨基酸序列，其序列可以是LVPGTLEEV，或其变异序列；食管癌肿瘤抗原 NY-ES0-1蛋白上第71-79位的氨基酸序列，其序列可以是GLNGCCRCG，或其变异序列；食管 癌肿瘤抗原NY-ES0-1蛋白上第124-132位的氨基酸序列，其序列可以是KEFTVSGNI，或其变 异序列。 本专利技术的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合，又包括热休克蛋白以 共价键与多肽结合。本专利技术提供了制备本专利技术的如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和 HSP78的复合物的方法。 本专利技术所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠 中诱导形成特异性的CTL。 本专利技术所诉的表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳 性食管癌患者PBMC分泌IFN- γ，且这种作用在自体gp96免疫后显著增强。 本专利技术所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性食管 癌患者特异性T细胞反应。 本专利技术所述的特异性CTL的诱导可以被Treg细胞的抑制剂增强。 首次从五例食管癌肿瘤组织中与热休克蛋白gp96结合的多肽中分离出一特异9 肽，经氨基酸序列分析为"GTLEEVPAA"，经查询发现该序列位于食管癌特异性抗原MAGE-A4 的49-57位，人工合成该序列并与体外表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-9肽复合物， 将该gp96-9肽复合物免疫HLA-A2转基因小鼠，能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞 (CTL)，且应用调节性T细胞的抑制剂可以增强gp96-9肽复合物的免疫效果2倍以上。实 验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型食管癌的治疗性药物。 附图简要说明 图1.小鼠（BALB/CHLA42+)的特异性CTL反应。以9肽和gp96-9肽复合物按0、1、3周 的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶 细胞的裂解百分率以4小时标准51Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50 和100,图中裂解率为10只小鼠平均值。 图2. gp96_肽段1免疫的小鼠脾脏淋巴细胞可抑制裸鼠皮下接种的食管癌细胞的 生长。裸鼠皮下接种人食管癌细胞TE-1，荷瘤7天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。 抗原肽1组（n=20)的接受经过gp9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与热休克蛋白结合的表位肽GTLEEVPAA，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄锡坚，张小俊，
申请(专利权)人：深圳市康尔诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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