一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术制造技术

本发明专利技术是基于微流液滴技术实现一步法连续制备可固载生物活性物质、多腔室海藻酸钙微凝胶，能够实现高通量，连续生产微凝胶材料。首先利用微流通道中不同水凝胶预聚体溶液可以形成平行的、稳定流场，从而将构成微凝胶不同腔室的水凝胶预聚体溶液注入微流芯片形成多相平行流体的水相溶液，随后通过T型通道或流体聚焦设计的微流通道将其与不共混的流体(油相)混合，形成油包水乳液液滴，液滴形成后立即引发液滴中海藻酸的交联，实现多腔室微凝胶制备；随后通过在微流芯片上实现乳液液滴的清洗，从而使微凝胶被快速的运送到水相中，实现一步法制备固载有生物活性物质的海藻酸钙微凝胶，尤其适于产业化应用。

Microfluidic technology for continuous preparation of calcium alginate microgel by one-step process

The invention is based on a one-step preparation of bioactive substances and multi chamber calcium alginate microgels by one step method based on the micro flow droplet technology, and can achieve high flux and continuous production of microgel materials. First, a parallel and stable flow field can be formed by using different hydrogel prepolymer solutions in the microfluidic channel, and then the hydrogel prepolymer solution, which is composed of different microgels, is injected into the microfluidic chip to form the aqueous solution of the multiphase parallel fluid, and then it is not blended by the T channel or the microfluidic channel designed by the fluid polycondensation. The fluid (oil phase) is mixed to form an oil emulsion droplet. After the droplet formation, it immediately causes the crosslinking of the hydrocidic acid and realizes the preparation of the multi chamber microgel. Then the emulsion droplets are cleaned on the microchip, so that the microgel is quickly transported to the water phase to achieve a one-step preparation of the biologically active substance. The quality of calcium alginate microgel is especially suitable for industrial application.

【技术实现步骤摘要】
一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术
本专利技术属于材料微加工领域、生物材料制备
、组织工程和细胞治疗领域，特别涉及一种利用微流控装置制备包埋固载活体细胞或生物活性分子药物的微凝胶。
技术介绍
近年来，水凝胶在许多生物医学领域都得以广泛应用，尤其是在组织工程领域，水凝胶已经成为非常重要的生物材料。水凝胶是由不溶于水但却能被水溶胀的高分子组成的交联网络，与人体组织器官类似，是由富含水的多孔网络构成，这样的多孔结构类似人体的组织器官，非常利于物质有效交换。同时，有些由天然高分子组成的水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及和人体组织近似的机械性能，因此，其可作为组织工程支架材料支持细胞的生长和组织再生。水凝胶材料中的一个分支是由生物大分子预聚体组成，其具有良好的生物相容性，凝胶化条件温和，因而这类材料被广泛用于细胞的三维包封。其中，许多天然高分子材料包括胶原蛋白，纤维蛋白，或者海藻酸盐等均属于此类材，被大量地用于细胞的包埋。虽然，水凝胶作为生物医用材料，在组织工程领域被大量研究和使用，但是传统水凝胶包埋细胞技术在组织工程应用中仍存在诸亟需解决的问题：1)块体水凝胶尺寸较大(>1cm)，高分子网络孔径尺度在纳米级，生物大分子由于扩散速率和距离低，因此包埋于块体凝胶中的活体细胞由于营养物质和代谢产物交换效率低而存活率下降；2)水凝胶作为生物活性物质递释的载体不具备可注射性，只能进行块体植入，而不能利用微创介入方式进行植入；3)块体水凝胶用于大分子或细胞包埋过程中，难以保证载荷物质在凝胶体系中均匀分布。相反，使用微米尺度的微凝胶作为生物活性物质的载体为解决上述问题提供了有效方案。因为微凝胶尺度小，有利于物质快速扩散，包封于其中的细胞能与外界的营养成分、信号因子和排泄物等都能够实现有效的交换。同时，微凝胶颗粒可以直接注射，为活性大分子药物和活体细胞的直接静脉注射移植提供了有效的途径。因此，实现载细胞微凝胶的高通量制备将有利于推进组织工程和细胞治疗技术的发展和临床应用。乳液技术被广泛用于制备包封生物活性物质(如生物活性大分子药物或者活体细胞)的微凝胶。该方法通常利用水油两相不共混流体在剪切力作用下形成分散相和连续相。典型的制备方法是：首先，将生物活性物质(例如生物活性大分子或活体细胞)分散在水凝胶的预聚体水溶液中，该水溶液与连续的油相共混可形成油包水的单乳液，随后诱发聚合或交联反应使液滴内的水凝胶预聚体凝胶化得到固化的微凝胶。这些传统的乳液法存在以下问题：1)活体细胞需要长时间的分散在分散的微乳中，细胞无法和液滴外的进行营养物质和气体的交换，因此细胞的代谢活力逐渐减弱，长时间处于乳液中会造成细胞活性的降低；2)为形成稳定的乳液，往往需要在油相或水相中加入表面活性剂，而表面活性剂往往会破坏细胞膜而产生细胞毒性，因此细胞长时间接触表面活性剂也存在潜在的细胞毒性问题；3)为引发水凝胶的聚合或交联通常需要使用有细胞毒性的交联剂或交联反应引发剂，而细胞长期接触这些成分同样存在细胞毒性的问题。因此，传统的乳液法制备细胞固载微凝胶技术难以维持细胞的高存活率和细胞的代谢活性，并且需要在固载后进行额外的费时费力的油相清洗的工作，因此无法用于产业化连续加工。近期涌现出一批可用于细胞固载的微加工技术，包括光刻蚀技术、微模板技术、乳液技术等，都存在如何维持固载细胞存活率的问题，因此难于真正用于细胞固载微凝胶的产业规模化生产。而且，这些传统技术都是基于批量化的生产工艺，无法实现高通量的连续制备，且批次间产品性能存在差异。微流控液滴技术是基于微流控芯片精确控制不互溶多相流体的微加工技术，该技术可实现连续进样，快速生产单分散性、可精确控制尺寸的微凝胶或微胶囊。与传统的油包水(W/O)或水包油(O/W)单乳液液滴技术相比，可通过具有T型流道或流体聚焦结构的微流控装置制备出具有均一尺寸的单乳液液滴。并且可以此为模板，通过不同聚合方式制备单分散的微凝胶。然而，和传统乳液法相同，微流控单乳液液滴技术并不适用于连续加工载细胞微凝胶。这是由于在制备样品的过程中，被固载的细胞会长时间暴露在油相、表面活性剂、交联剂等而造成细胞毒性。因此，需要间断的收集产物并迅速破除乳液，将细胞转移到生物相容性的水相溶液中，来保持制备的微凝胶中的细胞存活率，加工过程费时费力。因此，如何实现细胞在被固载入微凝胶并快速从油相中分离将极大地保证细胞活性，并可实现连续制备，提高生产效率。另外，水包水(W/W)乳液技术也可以实现微凝胶的制备。该方法使用含水的两相流体，利用两相间不共混可形成液滴，并以液滴作为模板，实现在水溶液中生产微凝胶微粒。该方法避免了额外的破除乳液的步骤，可实现一步法细胞包埋。然而，这一体系限于特定不共混的含水溶质的组合，如葡聚糖和聚乙二醇，且含水溶质浓度高，从而限制了这一方法的在细胞固载方面的广泛应用。综上所述，尽管载细胞微凝胶技术在生物医学领域具有重要的应用价值，然而如何实现细胞固载包埋于微凝胶，并同时维持细胞的存活率，仍然是这一领域亟需解决的技术难题。这促使科研工作者开发更简单、效率更高、可实现产业化生产的新技术。尽管微凝胶材料在生物医药领域具有重要应用潜力，其功能和结构相对单一，难以进行更多的功能性扩展。因此多腔室微凝胶材料近期成为生物医药应用和研究的热点。多腔室的微凝胶颗粒是由两个以上不同腔室组成的微凝胶材料，不同腔室可以是相同或不同材料。与传统单腔室微凝胶相比，多腔室微凝胶具有多重结构，可以赋予不同的功能。多腔室微凝胶由于复杂的结构和功能，在生物医药领域，尤其是生物活性物质固载和递释领域有着重要的应用潜力。现有的制备多腔室微凝胶材料的方法通常是将几种不同的水凝胶单体或预聚体的水溶液，进行乳化并快速引发聚合或交联，从而得到稳定的多腔室结构的微凝胶颗粒。常用的制备多腔室微凝胶的材料有可以通过光引发交联的水凝胶预聚体，或者可快速离子交联的海藻酸盐等。但这些快速、剧烈的交联反应通常具有很强的生物毒性，会影响被固载物质的生物活性，尤其是包埋细胞时，这些方法普遍细胞毒性强，因此使得细胞存活率明显下降，限制其在此领域的发展与应用。多腔室微凝胶由于复杂的结构和功能，在生物医药领域，尤其是生物活性物质固载和递释领域有着重要的应用潜力。现有的制备多腔室微凝胶的技术包括微流控芯片技术【Y.Du,E.Lo,S.Ali,A.Khademhosseini,P.NatlAcad.Sci.2008,105,9522-9527；S.Seiffert,Angew.Chem.Int.Ed2013,52,11462-11468】、流体刻印技术【D.Dendukuri,D.C.Pregibon,J.Collins,T.A.Hatton,P.S.Doyle,Nat.Mater.2006,5,365-369；b)D.Dendukuri,S.S.Gu,D.C.Pregibon,T.A.Hatton,P.S.Doyle,Lab.Chip2007,7,818-828.】、和离心制备工艺【K.Maeda,H.Onoe,M.Takinoue,S.Takeuchi,Adv.Mater.2012,24,1340-1346】。流体刻印技术【D.Dendukuri,D.C.P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：包括如下步骤：(1)配制溶液①以水溶性海藻酸盐为原料溶解于水中制备海藻酸水溶液，加入交联反应引发剂，再将生物活性物质和/或纳米颗粒分散于上述水溶液中得水凝胶预聚体溶液，作为水相溶液，其中：所述交联反应引发剂选自钙‑乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、钙‑氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸钙纳米颗粒、硫酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒中一种或几种的组合；所述交联反应引发剂的终浓度以钙含量记为10‑1000mM；②将氟化油、氟化表面活性剂和酸性物质共混得第一重油相；③将氟化油与全氟醇或全氟酸共混得第二重油相；(2)将步骤①获得的水相溶液以第一流速注入微流芯片，以第二流速将第一重油相溶液从第二输入口注入微流芯片，水相溶液和第一重油相经过乳化通道共混，形成油包水乳液液滴；(3)以第三流速将第二重油相由第三输入口注入微流芯片，第二重油相与步骤(2)所得乳液在设置于乳化通道下游的混合通道中充分共混后，从输出通道流出芯片；将输出的溶液输入收集相水溶液，使载有生物活性物质和/或纳米颗粒的海藻酸钙微凝胶分散在收集相水性溶液中，收集水相溶液即得终产品。

【技术特征摘要】
1.一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：包括如下步骤：(1)配制溶液①以水溶性海藻酸盐为原料溶解于水中制备海藻酸水溶液，加入交联反应引发剂，再将生物活性物质和/或纳米颗粒分散于上述水溶液中得水凝胶预聚体溶液，作为水相溶液，其中：所述交联反应引发剂选自钙-乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、钙-氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸钙纳米颗粒、硫酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒中一种或几种的组合；所述交联反应引发剂的终浓度以钙含量记为10-1000mM；②将氟化油、氟化表面活性剂和酸性物质共混得第一重油相；③将氟化油与全氟醇或全氟酸共混得第二重油相；(2)将步骤①获得的水相溶液以第一流速注入微流芯片，以第二流速将第一重油相溶液从第二输入口注入微流芯片，水相溶液和第一重油相经过乳化通道共混，形成油包水乳液液滴；(3)以第三流速将第二重油相由第三输入口注入微流芯片，第二重油相与步骤(2)所得乳液在设置于乳化通道下游的混合通道中充分共混后，从输出通道流出芯片；将输出的溶液输入收集相水溶液，使载有生物活性物质和/或纳米颗粒的海藻酸钙微凝胶分散在收集相水性溶液中，收集水相溶液即得终产品。2.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：所述的微流芯片具有流体聚焦结构、T形混合结构、同向流动型或十字结构的微流通道，具有至少3相液体输入口，以及乳化通道和输出通道。3.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术其特征在于：所述海藻酸原料为海藻酸、海藻酸盐、海藻酸盐水溶液或海藻酸与水溶性高分子的混合物。4.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：其中预聚体溶液中海藻酸原料总浓度为0.1-8w/v％。5.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：步骤(1)中所述的被包埋生物活性物质和/或纳米颗粒选自下述一种或几种的组合：活体细胞、水溶性的活性蛋白药物分子、纳米颗粒；所述活体细胞为原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体；所述水溶性的活性蛋白药物分子为蛋白质类药物、多肽类药物、酶类药物和细胞生长因子；所述纳米颗粒为纳米金、纳米银、纳米氧化铁等金属或金属氧化物纳米颗粒，聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸等高分子聚合物纳米颗粒，脂溶性维生素、喹诺酮类非水溶性药物纳米颗粒，羟基磷灰石、二氧化硅、磷酸钙、纳米碳管、石墨烯无机非金属材料纳米颗粒；所述纳米颗粒尺寸直径大于5-1000nm。6.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：所述氟化油选自下述一种或几种的组合：全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟丁基-甲基醚、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟癸烷、全氟十一烷、全氟十二烷、全氟十三烷、全氟十四烷、全氟十五烷、全氟十六烷、全氟十七烷、全氟萘烷。7.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术，其特征在于：所述氟化表面活性剂选自下述一种或几种的组合：全氟醚、全氟烷基酸全氟醚-聚乙烯醇嵌段共聚物、全氟醚-聚乙烯醇-全氟醚嵌段共聚物表面活性剂；其中氟化表面活性剂的浓度为0.1-10wt％。8.根据权利要求1所述的一步法连续制备海藻酸钙微凝胶的微流控技术特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华楠，张丽媛，
申请(专利权)人：王华楠，
类型：发明
国别省市：辽宁,21