人工肝细胞微流体微囊制备方法及其微流体微囊发生装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其该方法的专用设备—一种微流体微囊发生装置。本发明专利技术利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体对分散相液体的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊。本发明专利技术制备得到的人工肝细胞微囊，能较长时间的维持囊内种子细胞功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织工程和实验室设备
，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其―种微流体微囊发生装置。
技术介绍
肝衰竭是常见的危重疾病，病情复杂，死亡率高。肝移植是治疗肝衰竭较为有效的方法，但临床上供体肝来源严重缺乏，很多患者在等待移植的过程中死亡。因此急需专利技术一种切实有效的生物人工肝支持系统，来暂代肝脏功能，给患者自身肝脏恢复创造一个良好的环境，或帮助患者顺利过渡到移植手术期。生物人工肝支持系统中最核心的部分是种子细胞，该细胞能代替肝脏行使代谢、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自体肝细胞，然而到肝病终末期，患者自体肝细胞状态往往很差，难以胜任此工作。国内外研究较多的种子细胞有原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。常用的二维细胞培养模式很难维持这些细胞的功能。微囊化细胞培养技术是利用生物兼容性高分子材料形成微囊将细胞包裹在其中实现三维培养的一种技术，形成的微囊可以阻绝免疫细胞及大分子抗体进入囊内，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，能较好的保护囊内细胞维持细胞活性及功能。有学者将微囊化原代猪肝细胞应用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速气流(SugiuraS，OdaT，AoyagiY，eta1..Microfabricatedairflownozzleformicroencapsulationoflivingcellsinto150micrometermicrocapsules[J].BiomedMicrodevices，2007，9：91—99)、高压静电(WillaertRG,BaronGV.Gelentrapmentandmicro—encapsulation：methods,applicationsandengineeringprinciples[J].RevChemEng.,1996,12:185-205)等微囊发生装置难以得到大小稳定的微囊，且制作成本高，制作过程容易对细胞造成损伤。微流体技术是指采用微细加工技术制作出微通道网络结构，或者将各种微细管道把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同实验的技术。近些年来，该技术在化学、生物学等领域得到广泛应用，它不仅使试剂的消耗降低，而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势(林炳承,秦建华.微流控芯片分析化学实验室[J].高等学校化学学报,2009,03:433-445)。因此，开发基于微流体的微囊发生装置将简化实验步骤，缩小实验设备，精确控制微囊大小，减小微囊制作过程对细胞造成伤害。海藻酸钠凝胶因具有生物相容性好、细胞毒性较低、无免疫原性、可被生物降解、可以在适宜的条件下加工成形等优点，正被广泛应用于制作生物医学领域的微囊，例如甲状腺细胞、胰岛细胞、肝细胞的包囊(PrakashS.Artificialcelltherapy：Newstrategiesforthetherapeuticdeliveryoflivebacteria[J].JournalofBiomedicineandBiotechnology,2005，44—56)。单纯的海藻酸钠微囊化肝细胞，较传统的二维细胞培养模式能更好的维持肝细胞功能。但由于肝细胞生长的特殊性，例如贴壁生长、需要胶原支撑等，单纯的海藻酸钠微囊尚无法长时间维持其功能，离应用于生物人工肝系统还有一段距离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，本专利技术的另一目的在于提供一种人工肝细胞用微流体微囊发生装置。本专利技术的主要技术方案包括，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体(如豆油)对分散相液体(如海藻酸钠与氯化钙)的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊，并且在海藻酸钠凝胶中加入了胶原和磁性物质，让其更适合种子细胞三维生长和应用于生物人工肝支持系统。为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术的第一方面，提供了一种微流体微囊发生装置，包括上样推进组件、成囊组件、分离成膜组件；所述的上样推进组件，包括微量推注泵和三个注射器；所述的成囊组件，为连续的微流体通道；前端为微流体通道接入端，内置一个连续相通道和两个分散相通道；后端为中空的波形微流体通道；所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器和旋转成膜台；所述的旋转成膜台由转台和至少六个收集管组成。所述的微流体通道，包括采用硅、或玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷微流体芯片经微加工技术建立微流体通道网络或选择各种针头、聚合物管、中空纤维等粘合而成。所述的一个连续相通道和两个分散相通道分别与三个注射器相连；所述的波形微流体通道最后伸入油水分离器中；本专利技术的一种微流体微囊发生装置，还包括移液管，用于将油水分离器中分离得到的微囊移至旋转成膜台。本专利技术的一种微流体微囊发生装置，还包括网兜，用于盛接移液管移来的微囊，并放置于旋转成膜台的收集管中。本专利技术的一种微流体微囊发生装置，所述的油水分离器底部设置一个磁场发生装置。本专利技术的第二方面，提供了一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，所述的方法包括以下步骤：A、海藻酸钠混合溶液的制备：本步骤中的海藻酸钠混合溶液，为海藻酸钠混悬溶液未加种子细胞的溶液(即海藻酸钠混合溶液加种子细胞后称为海藻酸钠混悬溶液)。用生理盐水溶解海藻酸钠配制1.5％-2.0％(质量浓度)的海藻酸钠溶液，混入磁性物质，使磁性物质在海藻酸钠溶液中的比例为1-5mg/mL(重量体积比，W/V，优选2mg/mL)，将此混合物用钴60照射除菌；再以1：15-30(优选1：26)的体积比加入Matrigel基质胶，混合均匀，4℃冰箱保藏备用；B、微囊的制备分散相一，为种子细胞充分混匀于步骤A得到的海藻酸钠混合溶液中得到分散相一(AS)；分散相二，氯化钙(IS)，除菌；连续相，为不溶于水的油性介质(OI)，如大豆油、甲基硅油等，除菌；将AS、IS、OI分别装入注射器中，用微量推注泵推注入微流体通道中；在微流体通道中形成微囊后进入油水分离器，待微囊表面形成一层钙化的外膜后，进行油水分离，并用生理盐水洗涤；移至旋转成膜台，优选的用网兜兜住微囊后，依次通过0.1％多聚赖氨酸溶液——生理盐水——0.15％海藻酸钠溶液——生理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：A、海藻酸钠混合溶液的制备：用生理盐水溶解海藻酸钠配制1.5％‑2.0％的海藻酸钠溶液，混入磁性物质，使磁性物质在海藻酸钠溶液中的重量体积比为1‑5mg/mL，用钴60照射除菌；再以1：15‑30的体积比加入往上述溶液中加入胶原，混合均匀，4℃冰箱保藏备用；B、微囊的制备分散相一AS，为种子细胞充分混匀于步骤A得到的海藻酸钠混合溶液中得到分散相一；分散相二IS，1％‑3％的氯化钙溶液，除菌；连续相OI，不溶于水的油性介质，除菌；将AS、IS、OI分别装入注射器中，用微量推注泵推注入微流体通道中；在微流体通道中形成初级微囊后进入油水分离器，待微囊表面形成一层钙化的外膜后，进行油水分离，并用生理盐水洗涤；移至旋转成膜台，依次通过0.1％多聚赖氨酸溶液、生理盐水、0.15％海藻酸钠溶液、生理盐水、55mmol/L的柠檬酸钠溶液、生理盐水，得到最终的微囊。

【技术特征摘要】
1.一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，其特征在于，所述的方法包括以
下步骤：
A、海藻酸钠混合溶液的制备：
用生理盐水溶解海藻酸钠配制1.5％-2.0％的海藻酸钠溶液，混入磁性物
质，使磁性物质在海藻酸钠溶液中的重量体积比为1-5mg/mL，用钴60照
射除菌；
再以1：15-30的体积比加入往上述溶液中加入胶原，混合均匀，4℃
冰箱保藏备用；
B、微囊的制备
分散相一AS，为种子细胞充分混匀于步骤A得到的海藻酸钠混合溶液
中得到分散相一；
分散相二IS，1％-3％的氯化钙溶液，除菌；
连续相OI，不溶于水的油性介质，除菌；
将AS、IS、OI分别装入注射器中，用微量推注泵推注入微流体通道中；
在微流体通道中形成初级微囊后进入油水分离器，待微囊表面形成一
层钙化的外膜后，进行油水分离，并用生理盐水洗涤；
移至旋转成膜台，依次通过0.1％多聚赖氨酸溶液、生理盐水、0.15％
海藻酸钠溶液、生理盐水、55mmol/L的柠檬酸钠溶液、生理盐水，得到最
终的微囊。
2.根据权利要求1所述的一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，其特征在
于，所述的种子细胞为原代猪肝细胞、原代人肝细胞、人肝癌细胞株、IPS
类肝细胞、原代异体肝细胞。
3.根据权利要求1所述的一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，其特征在
于，该方法还包括步骤C、将步骤B获得的微囊置于37℃、5％CO2培养箱
中孵育。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，
其特征在于，步骤B中的油水分离中，在油水分离器底部添加一个0.5-1T
的磁场。
5.根据权利要求1、2或3所述的一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，

\t其特征在于，步骤B得到的最终的微囊，粒径为50--500μm。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴红平，金晓芳，唐为忠，
申请(专利权)人：上海赛立维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31