蛹虫草等虫草的人工培养方法技术

本发明专利技术是关于人工培养日本棒束孢、虫花棒束孢、蛹虫草以及高雄山虫草等虫草的方法。将上述菌株接种于以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养基上，或用人工饲料无菌养蚕法得到的蚕蛹上，在适当的环境下培养成与天然虫草相同的子实体。本发明专利技术可以利用缫丝后的蚕蛹，降低虫草的生产成本，防止药理活性的减退。此外，通过以无菌蚕蛹作为寄主，提高虫草菌的感染率，是稳定、连续、批量地生产虫草的有效方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真菌培养领域。特别是关于稳定、连续、批量地培养日本棒束孢(Isaria japonica Yasuda)、虫花棒束孢(Isaria farinosa(Hol.)Fr.)、蛹虫草(Cordyceps militaris(L)Link)以及高雄山虫草(Cordycepstakaomontana(Yakushiji et Kumazawa))(以下统称“虫草”)的方法。蛹虫草，自古以来就是中国的珍贵中药。近年来的大量研究表明，它还具有抗癌等重要的药用价值。此外，日本的学者通过研究发现，作为虫草属真菌之一的日本棒束孢和虫花棒束孢，也同样具有着增强免疫及抗癌的功能。因此，这些虫草在日本受到了人们的极大关注。但是，由于这些虫草的野生量有限，且采集困难，所以人们早就开始了人工培养方面的研究。其中，在日本提出的方法有一、将“冬虫夏草”的菌丝或子座孢子接种在既成食品的大蒜、酱油及砂糖的灭菌液体培养基上，或者将该液体培养基附着在大米、麦子及玉米等谷物或蚕、蝉等节肢动物昆虫类的成虫、蛹及幼虫上进行固体培养的方法(日本专利、特開昭54-80486号公報)。二、将“冬虫夏草”的菌丝体接种到由糖类、蛋白质类、维生素类及核酸类等其中的一种或数种物质为主要成分、并在其内加入谷物类而形成的立体固状培养基上进行培养，然后再将在该立体固状培养基上培养成的菌丝移植到由糖类、蛋白质类、维生素类及核酸类等其中的一种或数种物质为主要成分、并在其内加入氨基酸类的一种或数种物质、以水为基质PH值为4.0～7.0的液体培养基上进行静置培养，在液体培养基的表面形成菌座的培养的方法(日本专利、特公昭6153033号公報)。三、将“冬虫夏草”的菌丝体直接接种在活着的昆虫上、或者含有三分之一量的昆虫组织体的琼脂纯粹分离培养基上的方法。这里所使用的活昆虫是吐丝前的蚕(日本专利、特開昭62-107725号公報)。四、将在野外采集到的“冬虫夏草”，用琼脂培养基、液体培养基繁殖其菌丝和分生孢子，最后在野外进行大规模的栽培方法(日本专利、特開平6-233627号公報)。五、以鳞翅目昆虫为“冬虫夏草”菌的寄主，特别是使用自然状态的地蚕蛾和蚕蛾类的方法(日本专利、特開平8-75号公報；特開平8-172903号公報)。在上述培养的方法中，第三种方法的专利技术人指出了自己的第二种方法中的缺陷，即使用昆虫以外的成分为培养基，会出现药理活性减退的问题，作为连续的培养方法并非理想，同时提出了用与自然界中相同的活着的昆虫本体作培养基的方法。一般来讲，野外昆虫的体表和体内存在着各种杂菌，会降低虫草菌的感染率，所以第三种方法同样也不可能稳定地提供同一菌种。而上述的第四种方法中的野外栽培方式，也很难排除杂菌的感染，难以进行稳定的连续生产。同时，胞子的飞散还会给自然界造成影响。在中国，至今也提出了很多人工培养的方法。其中，具有代表性的是中国专利CN1092105A。该专利申请在指出了专利CN1034390A中所存在的缺陷之后，提出了以桑叶育蚕蛹作为寄主，将蛹虫草菌液注入蛹体内，待蚕蛹僵硬后用煤渣等多孔材料覆盖其上，形成子实体的方法。该方法由于使用的是桑叶育的蚕蛹，因此附着在桑叶以及蚕具上的杂菌，很容易使蚕蛹受到感染，从而引发蚕蛹的败血病。而将煤渣等多孔材料覆盖在蚕蛹上，又会给子实体收获的分离工作带来麻烦。此外，因受桑叶的季节限制，全年稳定、连续地提供蚕蛹将很困难。在日本目前缫丝后的蚕蛹经洗净、烘干用作家畜饲料。但在洗净过程中所产生的清洗废液流入河川，引起了污染。因此如何妥善地处理缫丝后的废蛹已成了亟待解决的问题。本专利技术的目的就在于要克服上述技术的不足，提出一个防止药理活性减退，提高虫草菌的感染率，并能稳定、连续、批量地生产虫草的方法。为此，提出了用以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养方法提供生产所需的孢子增殖源；以无菌蚕蛹作寄主进行继代培养的方法。现就具体内容说明如下本专利技术中所指的虫草，包括完全型的Cordyceps属和不完全型的Isaria属。将在野外采集到的天然成熟的虫草，用琼脂培养基按常法进行分离纯化，选出菌种。一、以蚕蛹的组成成分为主要成分的液体培养方法作为液体培养基的成分所使用的蚕蛹，可以是吐丝后的活蛹，也可以是将茧干燥后的干燥蛹，或者是缫丝后的蛹。缫丝后的蛹中，除了含有60％的粗蛋白质及9％的氮元素外，还含有很多虫草发育所需要的无机盐、糖原等的营养成分。蛹可以不经处理直接使用，但将干燥的蛹粉碎后再进行抽出，效果则更好。蚕蛹组成成分的抽出方法，有煮和使用高压灭菌器的方法。在沸腾以下的温度抽出时，可采用煮的方法。使用高于100℃的温度抽出时，可以使用高压灭菌器，这样能在短时间内抽出蛹的有效成分。抽出时蛹和水的比例为1∶2～5，用作培养液时，将此抽出液再用水稀释5～10倍。若不进行稀释，也可以直接用蛹的10～50倍的水进行抽出。如使用煮的方法，还要补加因蒸发而失去的水量。在上述的蛹抽出液内，根据虫草的不同，需要加入适量的碳水化合物、氨基酸、无机元素以及维生素等物质。其添加量约为蛹抽出液的2～8％。作为碳水化合物的有葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等；作为无机元素的有磷、钙、钾、钠、镁等。最后将配好的液体装瓶高温灭菌，待自然冷却后，即为液体培养基。除了上述的抽出方法以外，还有将干燥蛹粉碎后灭菌，不经加热抽出，仅在其内加入灭菌水，即为液体培养基的方法。同样，根据虫草的不同，加入适量的碳水化合物、氨基酸类、无机盐类以及维生素类等营养物质，效果则更好。在上述的液体培养基上，接种分离菌株。培养温度为15℃～25℃，湿度为75％～95％，自然光下进行。以上仅对液体培养基作了说明，这对加入琼脂的固体培养基也同样适用。二、以无菌蚕的蚕蛹作为培养基的培养方法本专利技术中所说的无菌蚕，主要是指排除了引起蚕发病的主要病原体的蚕。通常采用人工饲料无菌养蚕法可以得到。即将蚕卵的表面消毒，在无菌的蚁蚕上，投放蒸煮灭菌后的饲料，并在无菌装置内进行饲养。当然，用其他方法得到的不含有病原体的蚕也可视为无菌蚕。而用来作培养基的，是按上述方法饲养的蚕化蛹后的蛹(以下简称无菌蛹)。其中以复眼着色前的初化蛹为最理想。将菌株直接接种在蛹体上，在温度为15℃～25℃，湿度为75％～95％，自然光下培养。以下结合具体的实施例作进一步的说明。实施例1用蛹抽出液为主要成分的液体培养基人工培养日本棒束孢。蛹抽出液是用干燥蛹的5倍量的沸腾水，煮2小时后得到的。然后，将此抽出液再稀释5倍制成液体培养基，在该培养基上接种日本棒束孢菌。接种2～3日后在液体培养基上开始形成菌丝，一周后形成菌丝层，两周后开始出现子座原基。45～60日后形成4～8厘米的子实体并成熟。培养温度为15℃～25℃、湿度为75％～95％、自然光照下进行。此外，在蛹抽出液内加入适量的葡萄糖和无机元素后，与不添加的相比子实体苗壮色艳。用同样的方法，对虫花棒束孢也进行了培养。将虫花草棒束孢分离菌株接种3日后，开始形成白菌丝，11日后开始出现子座原基。45～50日后形成2～3厘米的细的子实体、呈淡黄色。此外，在该蛹抽出液内加入碳水化合物后，子实体可生长到3～4厘米，呈淡褐色，色泽鲜艳。实施例2回收上述方法得到的日本棒束孢孢子、制成菌液，接种在无菌蛹上。接种2本文档来自技高网...

【技术保护点】
人工培养日本棒束孢（Ｉｓａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｙａｓｕｄａ）、虫花棒束孢（Ｉｓａｒｉａ ｆａｒｉｎｏｓａ （Ｈｏｌ．）Ｆｒ．）、蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ （Ｌ．）Ｌｉｎｋ以及高雄山虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ （Ｙａｋｕｓｈｉｊｉ ｅｔ Ｋｕｍａｚａｗａ））的方法，其特征在于使用以蚕蛹的组成成分为主要成分的培养基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑞英，一田昌利，荒武义信，松原藤好，
申请(专利权)人：日原町，陈瑞英，
类型：发明
国别省市：JP[日本]